微生物来源碱性蛋白酶活性提高策略的研究进展

袁媛 王蕾 石亚伟

（山西大学生物技术研究所 教育部化学生物学与分子工程重点实验室，太原 030006）

蛋白酶是指能够将蛋白质降解成小肽和氨基酸的水解酶，占整个工业酶市场的60%。而碱性蛋白酶为在中性至碱性pH范围内具有活性的蛋白酶的统称。1945年，Jaag等［1］最早在地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis中发现了碱性蛋白酶。微生物蛋白酶大多属于胞外酶［2］，与动植物相比，微生物来源的碱性蛋白酶具有分离纯化过程简单、生产周期短且产率高的显著特点［3］。碱性蛋白酶具有较强的耐碱、耐热能力以及水解蛋白质的活力［4］，主要应用在洗涤剂工业上，尤其是洗衣和餐具洗涤剂的生产中。碱性蛋白酶的生产菌种和研究对象主要是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）及短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）［5］，如我国目前使用的地衣芽孢杆菌B.licheniformis2709，短小芽孢杆菌B.pumilus 289和209菌株等［6］。产碱性蛋白酶的放线菌较少，主要来源于链霉菌［7］。另外，某些霉菌也可以产生碱性蛋白酶。目前，我国碱性蛋白酶研究总体趋势发展较好，但国内企业仍不能实现高端碱性蛋白酶制剂的工业化生产，主要原因在于国外专利技术的垄断、国内优良的产酶菌株缺乏、酶的单位活力低、洗涤条件下酶的稳定性较差等［8-9］。因此，如何提高碱性蛋白酶活力迫在眉睫。

1 产碱性蛋白酶的微生物菌株改造

1.1 传统菌株诱变改造

这是早期微生物来源碱性蛋白酶研究工作中常用的一种策略，其原理是利用各种物理因素（常用紫外线和低能离子束）和化学试剂处理微生物细胞，使其发生基因突变，从而引起微生物菌株的遗传性状改变进而有利于获得高产碱性蛋白酶菌株［6］。Wang等［10］应用物理因素紫外线、60Co-γ射线以及化学诱变剂NTG对短小芽孢杆菌B.pumilus BA06进行诱变，得到产酶活力提高4倍的突变菌株SCU11。王晓云等［11］通过对实验室保藏菌株枯草芽孢杆菌BC2进行紫外诱变后，得到的突变菌株B38的产蛋白酶活性达到最高，相比出发菌株（27.68 U/mL）提高了3.14倍。王瑾等［12］对芽孢杆菌DL12菌株（酶活力为129.7 U/mL）进行诱变处理，筛选出1株碱性蛋白酶产量高的菌株，酶活力为172.3 U/mL。传统诱变改造的方法，虽然具有一定的优点，但它的弊端也很大，如费时费力、盲目性较大、效率低等。

1.2 太空诱变改造

随着航天事业的飞速发展，太空诱变开始慢慢兴起，其原理是利用卫星、飞船等将农作物种子或生物菌种带到太空，使产品因太空中特殊的环境条件而发生变异。刘雪等［13］以芝麻香细菌曲为诱变材料，搭乘“神舟十号”飞船进行空间诱变，返回地面后对诱变后麸曲中的细菌进行分离筛选，发现其中有一株产碱性蛋白酶能力最高的菌株，其酶活力是出发菌株的6.7倍。

1.3 原生质体融合改造

该技术的方法是利用原生质体的融合实现遗传重组，从而选育高产碱性蛋白酶菌株。潘延云及其团队将含有碱性蛋白酶基因的pDW2/ B.subtilis BD105的枯草杆菌工程菌与该基因的出发菌株地衣芽孢杆菌B.licheniformis 2709进行原生质体融合，筛选获得了酶活力最高达到30 778 U/mL的高产碱性蛋白酶的工程菌A16，比出发菌株高约50%-100%［14］。李宏［15］对芽孢杆菌 SD-142 的原生质体进行诱变处理，筛选到一株碱性蛋白酶酶活为2 759 U/mL的突变株。

1.4 基因工程改造

基因工程技术，主要利用DNA重组的原理，将目的基因插入载体，然后转入新的宿主细胞，构建成基因重组工程菌。1985年，Jacobs等［16］首次成功克隆到芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因后，利用基因工程技术构建高产蛋白酶工程菌就开始被广大科学工作者应用，为高产菌株的选育开辟了新路径［17］。Tang等［18］将来自地衣芽孢杆菌B.licheniformis 2709的碱性蛋白酶基因apr克隆到芽孢杆菌穿梭表达载体pHL中，最终在B.subtilis WB600中表达得到了高表达菌株BW-016，表达量增加了65%。Sareen等［19］将地衣芽孢杆菌B.licheniformis RSP-09-37的碱性蛋白酶基因在大肠杆菌E.coli JM109中进行表达。Lin等［20］成功将地衣芽孢杆菌2709的碱性蛋白酶基因Apr 克隆到表达载体pET-28b（+）中，得到重组质粒pET-28b（+）-Apr。黄磊等［21］将筛选获得一种高酶活的碱性蛋白酶的编码基因aprE209克隆入表达质粒pHY-WZX，再转入枯草杆菌B.subtilis WB600中，得到的重组酶的酶活力达到400 U/mL。利用该种方式构建工程菌的碱性蛋白酶的高产菌株，具有极强的目的性，克服了传统诱变的盲目性［22］，具有很大的应用潜力。

除了构建基因工程菌的方法，还可以通过基因敲除技术改造表达菌株。传统的基因编辑方法有同源重组整合载体法、反向筛选标记法和Cre/loxP定点重组法，其中利用同源重组的原理进行靶基因的基因敲除的原理图，如图1所示。基因敲除是选择合适的质粒，将靶基因两边的同源序列克隆至载体上，转入宿主菌后利用同源重组的原理实现对靶基因的置换敲除［23］。现今，CRISPR/Cas9基因编辑方法由于其具有周期短，操作简单的优点，得到人们的青睐。韩登兰等［24］成功构建了芽孢萌发缺陷型工程菌枯草芽孢杆菌B.subtilis 168ΔsleBΔcwlJ。刘洋等［25］利用pk18质粒作为自杀质粒并通过同源重组敲除的方式对其进行敲除，证明了NRPS-A与抗菌肽BBL的合成具有直接关系。赵银娟等［26］利用自杀质粒pMAD，最终获得不带抗性且ClpQY完全敲除的枯草芽孢杆菌B.subtilis 3610菌株。Zhou等［27］通过单独敲除参与孢子形成的调节基因（spo0A，sigF和sigE），最终发现ΔsigF的突变体的碱性蛋白酶酶活力相比野生型菌株高出了约19.7%。Zhou等［28］对地衣芽孢杆菌2709的lchAC基因和胞外粘多糖编码的eps簇敲除，通过筛选不同模块质粒和基因组位点之间最有效的表达系统，进一步优化了碱性蛋白酶基因（aprE）的表达。由于淀粉酶和几丁质酶是两种在宿主菌株中分泌量相对较高的天然细胞外蛋白，可阻碍碱性蛋白酶的分泌和表达，所以Zhou等［29］基于CRISPR/Cas9开发了一种高效的地衣芽孢杆菌基因组编辑系统将以上两种酶的基因敲除，结果表明，在两个基因均缺失的突变体中有效地提高了碱性蛋白酶的产量。近几年，CRISPR/Cas9在实验中的应用越来越广泛，很多课题组也在以此为基础不断的创新，相信未来的发展前景会更好。

图1 同源重组法基因敲除原理图Fig.1 Schematic mechanisms of gene knockout using homologous recombination

2 利用蛋白质工程提升碱性蛋白酶活性

在过去的30年中，蛋白质工程已经成为开发提升酶活性的重要工具。当前利用蛋白质工程技术对碱性蛋白酶的改造主要集中在提高其热稳定性、抗氧化性以及专一性等的研究中。Jaouadi等［30］通过蛋白质工程发现5个氨基酸：Leu31、Thr33、Asn99、Phe159和Gly182对短小芽孢杆菌B.pumilus 的SAPB的酶活性有重要影响，通过定点诱变构建了12个突变体，结果发现，三重突变体L31I/T33S/N99Y的比活最高，大约为野生型酶的2倍。Li等［31］通过对其N末端序列-1和-2处位置进行定点诱变，以提高链霉菌角蛋白酶Sfp2的表达水平，最终发现L（-1）F突变体（48 935 U/mg）的比活性是野生型Sfp2的9倍。石亚伟等［32］利用蛋白质工程技术，对PB92枯草杆菌蛋白酶进行改造，获得A188P+V262I碱性蛋白酶突变体，相比野生型，其热稳定性以及耐碱性均有明显提高，在两种洗涤剂体系（STPP体系和MGDA体系）进行评价，发现在不加任何保护剂和稳定剂的前提下，突变体相比亲本酶具有更优良的稳定性和洗涤性能。蛋白质工程技术出现至今已近40年，各项技术手段日渐成熟，结合大量的蛋白酶空间结构的揭示，进一步为利用在基因水平上通过氨基酸突变，提升蛋白酶的活性成为提升蛋白酶活力的重要手段。

3 通过优化启动子或信号肽的方式提升碱性蛋白酶的表达量

启动子作为转录水平调控中的关键元件，而信号肽是翻译阶段的重要元件，在这二者的基础上进行改造，对于蛋白酶表达调控是一种很好的策略。如Liu等［33］使用最佳表达系统（信号肽DacBSP和双启动子PBsamy-PBaamy）的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600在5 L发酵罐中培养以评估碱性蛋白酶的表达水平发现，在56 h的峰值为27 860 U/mL。Guan等［34］通过应用半理性启动子工程方法，构建了包含单启动子和双启动子的一系列表达质粒，发现双启动子PgsiB-PHpaII表现最佳。

启动子改造方面主要有通过启动子替换、串联启动子或不同启动子组合调控蛋白酶的表达，另外也可通过对启动子进行定点突变来调控蛋白酶的表达。史超硕等［35］分析解淀粉芽孢杆菌的 α -淀粉酶启动子P1、枯草芽孢杆菌的 α-淀粉酶启动子P2及启动子组合P-1-2、P-2-1对克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶aprE表达的影响，结果表明，发酵48 h后，双启动子重组菌枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高，达到了6 125 U/mL。杨春晖等［36］先通过基因克隆技术得到了短小芽孢杆菌B.pumilus的碱性蛋白酶基因的启动子片段，将其插入到穿梭质粒载体pSUGV4中，分别转入枯草芽孢杆菌B.subtilis和短小芽孢杆菌B.pumilus中进行表达，得到的碱性蛋白酶活性分别为466.5 U/mL和3 060 U/mL。

碱性蛋白酶生产菌株大多使用一般分泌（Sec）途径将蛋白质分泌到培养基中。所有分泌蛋白的一个共同特征就是它们的N端含有信号肽（signal peptide，SP），它们是之所以被分泌的重要识别位点。Degering等［37］构建了由220种地衣芽孢杆菌B.licheniformis的信号肽（称为异源SP）和173种枯草芽孢杆菌B.subtilis的信号肽（称为同源SP）组成的信号肽文库发现，来源于地衣芽孢杆菌B.licheniformis几丁质酶的信号肽dBli00338可以使碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌B.subtilis TEB1020中活性提高6-7倍。

在启动子和信号肽这些调控元件水平上对微生物碱性蛋白酶进行研究，也是目前在微生物碱性蛋白酶领域的热门研究方向。通过单独替换启动子、信号肽或将两者进行组合，比较分析不同启动子或信号肽对碱性蛋白酶的表达情况，选出最优方案，从而提高了微生物碱性蛋白酶的酶活力。

4 展望

随着对环境保护的日益重视，生物催化剂的使用越来越受到关注。微生物来源碱性蛋白酶在洗涤剂行业广泛应用是减少化学洗涤剂的不二选择。目前碱性蛋白酶仍然不能满足工业对多品种生产的增长需求，特别是在液体洗涤市场，我们需要面对的挑战包括酶产量低、酶活力低、稳定性差以及生产成本高等问题。除此之外，还需对碱性蛋白酶生产过程精确控制，特别是简化碱性蛋白酶的下游纯化工艺尤为重要。近年来合成生物学成为学科发展的一个新的热点，通过人工染色体构建、地盘细胞设计、全局转录调控等有望应用于碱性蛋白酶生产相关的多基因表达的调控［38］，加之开发更多便捷高效的芽孢杆菌基因编辑技术等有望获得人们理想的蛋白酶。但蛋白酶产品的实现，在酶制剂的发酵、分离纯化、稳定性方面仍然有赖于经典的蛋白类产品的发酵和提纯工艺的进步［39］。如何保持酶的高浓度、高纯度、高稳定性等，特别是在洗涤剂中的稳定，都是碱性蛋白酶活力提升绕不开的技术难题。不论采用何种途径提高碱性蛋白酶的酶活力，都有望扩大其在生物技术领域和工业领域中的应用。