一种快速精确测定Tth DNA聚合酶活性的方法

2021-06-23陈晓雨张建张新亚唐雨婷邵钰晨罗志丹卢辰

生物技术通报 2021年5期

陈晓雨张建张新亚唐雨婷邵钰晨罗志丹卢辰

（1.江苏海洋大学江苏省海洋药物活性分子筛选重点实验室，连云港 222005；2.江苏省海洋资源开发研究院（连云港），连云港 222005）

Tth DNA聚合酶是一种从嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）分离得到的耐热DNA聚合酶［1］。与同样来源于栖热菌属的Taq DNA聚合酶不同，在仅有Mg2+存在时，Tth DNA聚合酶表现出一般的DNA聚合酶活性；但还有Mn2+存在条件下，该酶同时具有耐高温逆转录酶活性和DNA聚合酶的活性［2］。因此自1990年发现Tth DNA聚合酶后，研究者很快将其尝试用于丙型肝炎、流感病毒等RNA病毒的逆转录-荧光定量PCR检测［3-5］。更重要的是，Tth DNA聚合酶对于血液、肌肉等生物组织中含有的PCR抑制成分具有较强的耐受性［6-7］，十分适合用于粗样本快速检测［8］。然而，野生型Tth DNA聚合酶存在比活力低［9-10］、热稳定性不如Taq DNA聚合酶［11］、Mn2+影响PCR扩增保真性［12］等缺陷，阻碍了其广泛应用。

近年来，随着蛋白质工程技术的发展，研究者开始重新审视Tth DNA聚合酶的改造和应用［13-15］。在此过程中，如何快速准确测定Tth DNA聚合酶的活性，是准确评估蛋白质改造和生产工艺优化效果的前提。目前测定DNA聚合酶活力的方法主要有：（1）同位素标记法，利用同位素3H标记的dNTP，把30分钟内在最适反应温度下将10 nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量定义为1个活力单位（U），该方法最为准确，也是国内外主流厂商约定俗成的DNA聚合酶活力定义标准。但受限于同位素操作资质与放射性防护条件，很难在普通实验室实现。（2）琼脂糖凝胶电泳或荧光定量PCR法，使用已标定酶活的对照品与样品扩增同样的模板，通过比较产物凝胶电泳条带亮度或荧光定量PCR的Ct值来计算样品活性相对于对照品的倍数。这两种方法只能实现相对定量，耗时长，且受对照品批次间活力标定不稳定因素影响较大，重复性差，灵敏度低。（3）荧光染料法。2018年国家标准化管理委员会发布了《Taq DNA聚合酶》的推荐性国家标准［16］，其中酶活检测采用了与同位素法类似的等温聚合反应，但最后使用双链特异性的荧光染料PicoGreen来定量测定新生成的双链DNA，避免了使用同位素。然而，该方法在74℃下直接测定双链产物的荧光值，忽略了此温度下产物中的双链大多数呈解链状态，使用双链特异性染料测得的荧光值根本无法反映真实的产物量，导致该标准并未被广泛采纳。此外，还有其他一些利用荧光标记探针的方法［17-19］，但探针设计复杂，荧光标记价格昂贵，且标记基团可能会影响聚合酶活性，也未能得到广泛应用。

本研究对国标所采用的荧光染料法进行了大幅改进，重新设计了标准曲线绘制和DNA双链产物量测定方式，期望建立一种准确度更高、重复性更好的Tth DNA聚合酶活性测定方法，并可以推广到其他DNA聚合酶，助推生物工具酶的研发与改造。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 rTth DNA聚合酶（5 U/μL）：东洋纺（上海）生物科技有限公司；PicoGreen染料：苏州宇恒生物科技有限公司；dNTP混合液（2.5 mmol/L each）：江苏愚公生命科技有限公司；SYBR Green I染料：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。TE缓冲液（pH 8.9）配方：10 mmol/L Tris-Hcl，1 mmol/L EDTA，pH 8.9（25℃）。野生型Tth蛋白与I640F突变体蛋白：本课题组自行重组表达。

1.1.2 仪器设备 Qubit 4荧光计：Thermo Fisher Scientific公司；Synteny Neo2多功能酶标仪：美国BioTek公司；LightCycler480 II荧光定量PCR仪：瑞士罗氏集团；恒温金属浴：杭州米欧仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 探针设计与合成起始探针H1为一段寡聚脱氧核苷酸，包括16 bp的配对区和5′端25 nt的单链区。该探针可自行形成茎环结构，其3′配对区作为引物，以5′端未配对的25 nt单链区为模板，加入DNA聚合酶和dNTP后即可进行DNA聚合反应，从而形成完整的41 bp配对，产物命名为H2（图1）。委托通用生物系统（安徽）有限公司合成H1和H2样品。

图1 发夹型探针示意图Fig.1 Hairpin probe

1.2.2 H2含量与荧光增加值的线性关系使用Qubit 4 荧光计精确测定所合成的H1和H2两种探针的双链配对区域浓度（ng/μL），根据H1和H2的配对区核苷酸序列，使用在线工具（http：//www.endmemo.com/）换算成摩尔浓度。然后用TE缓冲液（调整到 Tth聚合酶最适pH 8.9）将H1和H2均稀释为 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L 和 0.8 μmol/L 三组。每组相同摩尔浓度的H1和H2溶液，再与PicoGreen染料和TE缓冲液按表1所示不同比例混合，配制成100 μL（此体积为酶标仪可准确检测的最小体积）的探针工作溶液，每种比例设置3个重复。

将上述6种工作溶液放入多功能酶标仪中，在30℃下，以480 nm波长激发，520 nm发射测定荧光值。将每个比例工作溶液测得的荧光值，减去仅含H1探针工作溶液的荧光值，得到含有不同浓度H2探针工作溶液的荧光增加值。然后以100 μL工作溶液中H2探针含量（单位pmol）为横坐标，荧光增加值为纵坐标，使用GraphPad Prism软件进行线性回归，验证H2探针含量与荧光增加值之间的线性关系及线性范围。取线性关系较好的一组为标准曲线，建立回归方程，并以该浓度H1溶液作为后续酶活测定的底物溶液。

表1 标准曲线探针工作溶液配方Table 1 Probe working solution formulations for standard curve

1.2.3 酶活测定及饱和度实验将商业化rTth DNA聚合酶原液稀释500、1 000、2 000、4 000和8 000倍，分别配制表2的酶活测定反应体系，每组设置3个重复。同时配制不加酶液的阴性对照。

表2 Tth DNA聚合酶活性检测反应体系Table 2 Reaction system for Tth DNA polymerase activity assay

国际上通行的Tth聚合酶1个活力单位（U）定义为30 min内在74℃下将10 nmol dNTP掺入酸不溶物所需的酶量。因此将配好的反应溶液在74℃下分别孵育5 min、15 min和30 min后，加入1 μL 0.5 mol/L EDTA溶液终止反应。然后缓慢冷却到室温使产物退火复性为双链，加入0.5 μL PicoGreen染料，再用TE缓冲液（pH 8.9）稀释到100 μL，放入酶标仪在30℃下测定荧光值。用反应后溶液相对不加酶液阴性对照的荧光增加值，与反应时间作图。如果某个稀释倍数下，荧光增加值与反应时间呈线性关系，则可将反应30 min后的荧光增加值代入标准曲线方程中，计算出100 μL反应体系中产物H2的含量（pmol），按下式计算得到原酶液活力：

原酶液活力（U/μL）=（30 min产物量（pmol）×25 × 稀释倍数）/ 10000

荧光增加值与反应时间呈线性关系的稀释倍数区间所对应的稀释液酶活，即为本方法的定量范围。

1.2.4 荧光定量PCR验证取本实验自行重组表达获得的Tth DNA聚合酶野生型蛋白（1.57 mg/mL，纯度＞90%）和I640F突变体蛋白（1.48 mg/mL，纯度＞90%），均稀释200、500和1 000倍后，采用上述方法测定原液酶活。然后使用商业化rTth、重组表达野生型Tth和I640F突变体3种原酶液，以同样浓度的pUC18质粒为模板，使用相同引物（引物序列为 F：5′-AGTGGGTTACATCGAACTGGATCTC-3′，R ：5′-GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCA-3′），采用SYBR Green I染料法按相同程序进行荧光定量PCR。将3种酶液对应的Ct值差值换算为产物量相对倍数，与本方法测得的活力进行对比。

2 结果

2.1 核酸产物与荧光增加值的线性关系

根据PicoGreen荧光染料说明书，该染料对双链核酸的结合力是单链的1 000倍以上，且当双链核酸浓度在1 ng/μL以下时，受激产生的荧光值与碱基对数量成正比。本研究首先使用总摩尔数相同但比例不同的H1与H2混合，模拟H1不断反应生成H2的过程，该混合液相对仅含H1溶液的荧光增加值，理论上应当与H2相对H1增加的25 bp配对区（图1）的摩尔浓度之间存在良好的线性，但线性范围需要摸索。实验结果表明，当实际配制的H1、H2母液浓度为0.43 μmol/L，对应100 μL工作液中H2探针双链部分最高浓度为1.15 ng /μL时，H2含量与荧光增加值之间存在良好的线性关系，决定系数R2达到0.99以上，且3次重复测定间的偏差较小（图2）。而探针母液浓度达到0.6 μmol/L以上（对应工作液中H2探针双链部分最高浓度为1.5 ng /μL以上）时，线性关系较差。

图2 荧光增加值与H2含量的标准曲线Fig.2 Standard curve of fluorescence intensity added and H2 content

2.2 Tth DNA聚合酶活性测定及定量范围

将原酶液稀释500倍和1 000倍后，反应5 min、15 min和30 min时的荧光增加值之间已明显不呈线性关系，不能用于测定酶活；而稀释2 000倍和4 000倍后，不同反应时间荧光增加值之间线性关系良好（图3），因此可以选择这两个稀释倍数来计算酶液活力。

图3 不同稀释倍数的rTth聚合酶在不同反应时间下的荧光增加值Fig.3 Fluorescence intensity added of rTth polymerase with different dilution ratios at different reaction times

由表3可知，稀释2 000倍后测得的原酶液酶活为5.48 U/μL，稀释4 000倍后测得的原酶液酶活为5.31 U/μL。考虑到酶液生产厂商在分装时一般会在标定值基础上给予10%-20%左右的冗余，可以认为本方法测定的结果与标定值相符。而当将原酶液进一步稀释8 000倍后，荧光增加值与反应时间的关系变得紊乱。因此认为本方法可以定量的稀释液酶活范围是 1.33×10-3-2.74×10-3U/μL。

2.3 荧光定量PCR验证酶活

将本课题组重组表达获得的野生型Tth DNA聚合酶蛋白和I640F突变体蛋白均稀释200、500和1 000倍，使用上述方法测定酶活。结果表明200倍稀释后两种蛋白的荧光增加值与反应时间呈线性关系（图4-A，4-B），计算得到的原液酶活分别为0.27 U/μL 和 0.57 U/μL。

表3 商业化Tth DNA聚合酶活性测试结果Table 3 Results of commercial Tth DNA polymerase activity assay

然后使用商业化rTth、自主表达野生型Tth和I640F突变体三种原酶液对相同的pUC18质粒模板进行荧光定量PCR反应。结果表明，野生型Tth DNA聚合酶得到的Ct值，与商业化rTth的Ct值相差4.28个循环，而与I640F突变体相差0.99个循环（图4-C，表4）。折算成产物量可知，使用相同模板进行PCR后，野生型Tth获得的产物量是商业化rTth的1/19.4，是I640F突变体的1/2，与本方法测得的酶活比例相符，表明本方法测得的酶活可以反映真实使用环境下的Tth DNA聚合酶活性。

图4 重组表达Tth野生型与突变体蛋白的酶活测定与荧光定量PCR验证Fig.4 Activity assay and fluorescence quantitative PCR validation of recombinant WT Tth and its mutant polymerase

3 讨论

本研究建立的酶活测定方法与现有方法相比体现出3个优势：（1）无需同位素即可实现对Tth DNA聚合酶活性的绝对定量。已有研究证明，PicoGreen染料与产物双链DNA结合激发的荧光值，与3H同位素标记所测得的dNTP掺入量有很好的相关性［20］，本研究实验结果也证明本方法测得结果与商业化标定酶活一致，完全可以取代同位素。（2）利用未进行聚合反应之前的发夹型底物H1和发生聚合反应之后生成的产物H2，以一定的比例混合来设置标准曲线，最大程度模拟了聚合反应开始后的H1不断消耗生成H2的动态变化，使标准曲线更真实地反映了酶活测定反应体系中的实际情况。本研究所绘制的标准曲线相关系数达到0.99以上，重复实验之间偏差小，表明本方法的标准曲线准确度和重复性都比较理想。（3）反应30 min后不在74℃下直接测定荧光值，而是终止反应后将温度降至30℃，使高温下大部分解链的双链重新退火形成完整双链，测得的荧光值才能真实反映双链产物的含量。本方法不仅可以用于Tth DNA聚合酶的活力测定，也可以推广到Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶等不具备3′-5′外切酶活性的各类DNA聚合酶活性测定。

表4 测得酶活与荧光定量PCR Ct值对比Table 4 Comparison of measured enzyme activity and fluorescence quantitative PCR Ct values

由于PicoGreen染料的荧光值与双链DNA配对数仅在一定范围内体现出良好的线性（官方标称线性范围是 1 pg/μL - 1 ng/μL，本研究实测在 1.5 ng/μL以上线性较差），故而测试反应体系中H1底物浓度不可太高。而在酶活测定过程中，要求底物在反应到30 min时仍然是过量的，因此本方法初步验证得到的定量限，即加入反应体系的酶浓度一般应在1.33× 10-3- 2.74 × 10-3U/μL之间。这一方面表明本方法灵敏度极高；另一方面对于未知样品，则需要多次尝试高倍数梯度稀释才能获得较理想的结果。未来将进一步优化以扩展该方法的测量范围。