高效液相色谱法快速测定腊肉中苯并芘的含量

2021-06-23李单单

肉类工业 2021年5期

李单单

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腊肉是湖北、四川、湖南、江西、云南、贵州、甘肃陇西、陕西的特产，已有几千年的历史。其基本做法是将一定比例的食盐和多种香辛料混合放在肉中进行腌制7～15d，然后把肉串挂起来，把水滴干，再用柏树枝、甘蔗皮、椿树皮或柴草火熏烤，随后挂起来用烟火慢慢熏干而成。烟熏的主要目的是赋予腊肉特有的色泽和风味。但在高温条件下熏材的不完全燃烧会产生一种致癌性较强的化学物质苯并芘，烟熏温度越高，产生的致癌物就越多。

苯并芘(Benzopyrene)是一种含苯环的稠环芳烃，在环境中广泛存在[1]。苯环的稠合位置不同，苯并芘分为2种，苯并[a]芘(1，2-苯并芘)和苯并[e]芘(4，5-苯并芘)。常见的是苯并[a]芘，英文缩写B[a]P，CAS号为50-32-8，化学式为C20H12，分子量为252.31。常温下状态为黄色粉末，熔点为179℃，溶解度方面难溶于水，微溶于甲醇、乙醇，易溶于苯、甲苯、二甲苯、丙酮、乙醚、氯仿、二甲基亚砜等有机溶剂。最初由煤焦油中分离得到，从煤烟、焦油、沥青、香烟烟雾中都可以查出，有强烈的致癌作用，可以诱发肺癌，其在大气中的含量已经列入环境监测的常规项目[2]。动物实验证明，苯并芘具有致癌、致畸和致突变型，其在食品、油脂、水体和土壤中广泛存在。4，5-苯并芘(苯并[e]芘)是1，2-苯并芘的同分异构体，存在于煤烟和焦油中。苯并芘在工业上无生产和使用价值，一般只作为生产过程中形成的副产物随废气排放。最早于1933年，英国科学家J.W.Cook等人从沥青中分离得到苯并芘纯品，合成证明了其化学结构，并进行动物实验，诱导小鼠产生了皮肤癌，由此，苯并芘被确认为是第一个化学环境致癌物[3]。

目前针对苯并芘的测定，相关文献中多采用酶联免疫吸附测定法[4]、胶体金法[5]、气相色谱-质谱联用法[6]、液相色谱-质谱联用法[7]、液相色谱-荧光检测法等[8～16]。采用食品安全国家标准GB 5009.7-2016《食品安全国家标准食品中苯并[a]芘的测定》中的液相色谱法测定苯并[a]芘时，由于腊肉的油脂多且成分复杂，苯并[a]芘的加标回收率低、且结果不好重现，因此需要建立一种有效快速测定腊肉中苯并[a]芘含量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱仪Waters Acquity Arc，美国沃特世科技有限公司，配waters2475荧光检测器；

色谱柱Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)；

固相萃取柱BaP-2，月旭科技；

固相萃取柱Silica，月旭科技；

固相萃取仪，美国安捷伦科技有限公司；

电子分析天平ML204T，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；

氮气发生器LCMS30-1-E，英国Parker；

氮吹仪N-EVAP 24，美国Organomation；

多位涡旋振荡器，广东晋元；

超声波清洗器，中国昆山舒美；

有机滤膜0.22μm，天津津腾公司。

1.2 试剂

分析纯二氯甲烷，天津市科密欧化学试剂有限公司；

分析纯正己烷，天津市科密欧化学试剂有限公司；

色谱纯乙腈，上海安谱实验科技股份有限公司；

实验用水为Milli-Q Advantage A10超纯水，美国Millipore公司。

1.3 标准曲线的绘制

1.3.1 标准物质

苯并芘，纯度99.6%，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3.2 标准储备液

准确称取一定量的苯并芘标准品，用乙腈定容至100mL，配制成1μg/mL的标准储备液。

1.3.3 标准工作液

吸取适量标准储备液，用乙腈+水=90+10稀释成浓度为100ng/mL的标准工作液，然后经过逐级稀释，用乙腈+水=90+10配制成浓度分别为0.4、1、2、4、8ng/mL的系列工作溶液。

1.4 样品前处理过程

1.4.1 样品提取

称取5g(精确至0.001g)已粉碎均匀的样品于50mL离心管中，加入10mL正己烷涡旋混合10min，40℃下超声提取10min，以6 000r/min转速于4℃冷冻离心5min，转移出上清液，再加入10mL正己烷重复提取一次。合并上清液待净化。

1.4.2 净化

依次用5mL二氯甲烷、5mL正己烷活化Silica-BaP-2串联柱，加入待净化液16mL，弃去全部流出液；加入5mL正己烷淋洗整个串联柱，然后弃去上面Silica硅胶柱，用5mL正己烷淋洗下面BaP-2柱，然后加入6mL二氯甲烷洗脱液，收集洗脱液并抽干，在洗脱液中加入0.5mL乙腈，40℃下氮吹至近干。然后用乙腈+水=90+10定容至1mL，供上机检测。

1.4.3 仪器条件

色谱柱：Cortecs-C18(4.6×50mm，2.7μm)。

流动相：乙腈+水=90+10。

流速：0.5mL/min。

柱温：35℃。

进样量：10μL。

检测波长：激发384nm，发射406nm。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

试验考察了C18色谱柱规格分别为(4.6×250mm,5μm)、(4.6×50mm，2.7μm)时对测定结果的影响。结果显示：在使用第一种色谱柱时，柱压较高，保留时间为16min，不利于样品的批量快速测定；在使用第二种色谱柱时，不仅能满足实验要求，且保留时间较短(3min左右)，能大大节省检测时间，因此试验选择C18色谱柱的规格为(4.6×50mm，2.7μm)。

试验进一步考察了标准系列和样品最后定容的溶剂对峰的影响。结果显示：以纯乙腈作为溶剂时，其峰高比流动相作为定容溶剂时低5%，纯乙腈定容时会有溶剂效应，因此最终的定容溶剂选择和流动相一致。

同时试验还考察了流动相中水和乙腈的比例分别为30∶70、20∶80、12∶88、10∶90、8∶92时对峰的影响。发现随着水的比例减少，目标峰出峰时间提前了，虽节省了检测时间，但水的比例过低时，杂峰增加，目标峰出现拖尾，且响应值降低。综合考虑，试验最终选择10∶90作为流动相。

按照1.4优化的前处理及仪器条件对1ng/mL苯并芘标准溶液、样品加标(2ng/g)进行测定，得到的色谱图见图1。

图1 苯并芘标准溶液(a)和样品加标(b)色谱图

2.2 线性关系、检出限及定量限

苯并芘标准溶液0.4、1、2、4、8ng/mL，按照优化好的色谱条件上机测定，得到各浓度点的色谱图。

根据色谱图，做出标准溶液的浓度X与峰面积Y之间的关系。结果表明，苯并芘在5min内即可完成检测，且在0.4～8ng/mL的标准浓度范围内具有良好的线性关系，线性回归方程为Y=3.40×106+5.86×104，相关系数R2=0.9999，同时根据信噪比S/N=3和S/N=10确定目标物的检出限和定量限，苯并芘的检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。苯并芘的各浓度点色谱图、校准曲线、相关系数、检出限和定量限分别见图2和表1。

图2 各浓度点标准色谱图(a)和校准曲线(b)

表1 苯并芘的线性范围，回归方程，相关系数，检出限及定量限

2.3 精密度实验

以苯并芘标准溶液2ng/mL，按照1.4.3的仪器条件连续进样6次，测得苯并芘的保留时间和峰面积的相对标准偏差分别为0.002%和0.03%。结果表明该实验的色谱条件具有良好的精密度。

2.4 样品的加标回收率实验

准确称取5g制备好的腊肉样品，分别加入苯并芘标准品1、5、10ng，每个加标点做3个，按照1.4.1和1.4.2的方法进行样品前处理，然后按照1.4.3的方法进行上机测定计算加标回收率，测定结果见表2。结果显示，加标平均回收率在87.86%～90.20%之间，相对标准偏差在1.0～1.3之间，表明该方法的准确度和精密度良好，能够满足腊肉中苯并芘含量的检测要求。