不同工艺的决明子提取液对微生物生长抑制作用的研究

刘维兵 杨 林 包晓玮

1.青岛德慧海洋生物科技有限公司 山东青岛 266000 2.新疆农业大学食品科学与药学学院 新疆乌鲁木齐 830000

决明子是豆科植物决明Cassia obrtusifolia L.或小决明C.toraL.的成熟干燥种子。决明子是我国历史悠久的药用植物，最早《神农本草经》将决明子列为上品。决明子味甘、苦、咸，性微寒，善入肝、肾、大肠经，具有清肝明目、润肠通便的功效。决明子具有较好的抗菌、抗氧化、抗衰老等疗效。决明子抑制微生物的生长具有显著效果，是国家卫生部公布的药食同源的物质之一[1]。

决明子的乙醇提取物及氯仿提取物对多种细菌均有抑制作用。程玲铃[2](2005)等用中药决明子的乙醇提取物及氯仿提取物对核盘菌、镰刀菌、柑桔绿霉、棉花炭疽病菌等10余种植物病原菌进行抑菌活性筛选研究，结果表明决明子对植物真菌病原的抑制作用强于对植物细菌病原菌。决明子粗提液对棉花炭疽病菌的抑菌率达62%，对油菜菌核病菌的抑菌率达53%，均有比较好的利用前景。

本论文围绕决明子不同提取物对食源性致病菌的抑菌效果展开研究，为开发一款安全、新型环保的植物抗菌剂替代一部分抗生素的使用等提供一定可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与设备、仪器

1.1.1 材料

决明子，青岛德慧海洋生物科技有限公司；

比浊管，南京建成生物工程研究所；

魔芋粉，青岛市即墨区农副产品中心批发市场；

沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单抱杆菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌，上海保藏生物技术中心；

YPD肉汤、YPD培养基、LB肉汤、LB培养基，上海保藏生物技术中心。

1.1.2 设备、仪器

电子天平LE2002E/02，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

紫外-可见分光光度计TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司；

立式高压灭菌器LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂；

生物安全柜HR40-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司；

旋转蒸发器RE-3000E，上海耀特仪器设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品液的制备

取魔芋粉2g，加198mL无菌水、制成魔芋粉混悬液，漩涡震荡器震荡均匀，备用；取决明子粉5g，加蒸馏水95mL，漩涡震荡器震荡均匀，60℃静止浸提3h备用；取决明子粉5g加氯仿95mL，82℃冷凝回流提取，旋转蒸发至20mL左右，过滤，备用；取决明子粉5g，加95%乙醇95mL，82℃冷凝回流提取，旋转蒸发至20mL左右，过滤，备用；取决明子粉5g，加蒸馏水95mL，100℃回流提取，文火浓缩至混悬液总质量20g，备用。

1.2.2 菌种的活化和传代培养

单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单抱杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌：将斜面保藏的菌种，接种在Luria-Bertani液态培养基中进行活化，在36℃恒温培养箱内培养24h。后将菌液在Luria-Bertani培养基上画线，在36℃恒温培养箱内培养2～3d。菌种经过冷冻后，生长延迟期较长，故需经过2次继代培养，菌液待用[3～5]。

白色念珠菌：采用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基糖(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium Agar)培养基，其他活化、培养方法同单增李斯特菌等。

1.2.3 决明子对魔芋粉中菌落总数的抑制

配制好平板计数琼脂培养基，经高压蒸汽消毒灭菌后，倒入平板计数琼脂培养基，每皿约15～20mL，作为空白组A；在无菌操作下倒入魔粉混悬液1mL于干热灭菌好的培养皿内，再倒入冷却至50℃左右的平板计数琼脂培养基，即培养皿内培养基的厚度约2～2.5mm作为对照组B；在无菌操作下倒入魔粉混悬液1mL于干热灭菌好的培养皿内，再倒入冷却至50℃左右的平板计数琼脂培养基，加入1mL乙醇溶液(95%)，作为乙醇阳性对照组C；无菌操作下倒入魔粉混悬液1mL于干热灭菌好的培养皿内，再倒入冷却至50℃左右的平板计数琼脂培养基，后加入1mL氯仿溶液，作为氯仿阳性对照组D；决明子氯仿提取液E组、决明子乙醇提取液F组、决明子蒸馏水提取液G组、决明子粉蒸馏水浸提液H组，置于36℃恒温箱内培养48h。观察不同方法提取出的决明子提取液，对魔芋粉中菌落总数生长的抑制作用。

抑制率计算公式=(对照组菌落总数-试验组菌落总数)/对照组菌落总数

1.2.4 决明子对食源性致病菌的抑制

将菌液用比浊管定量至浓度为106CFU，配制好LB、YPD培养基，经高压蒸汽消毒灭菌后，定量分装到20mL提前灭菌处理的无菌试管中，待温度冷却至50℃左右加入100uL浓度为106CFU菌液，迅速倒入无菌平板中，待培养基凝固后放入牛津杯，每个平板三个平行，分别向牛津杯中加入200uL 95%乙醇作为A组、氯仿B组、蒸馏水C组、决明子乙醇提取物D组、决明子氯仿提取物E组、决明子蒸馏水提取物F组、蒸馏水浸提物G组，置于36℃恒温箱内培养48h。观察不同方法提取出的决明子提取液，在不同食源性致病菌上抑菌圈大小[6～9]。

1.3 数据处理

每次实验均进行3次重复操作，所有实验数据采用SPSS 16.0统计软件对结果进行显著性分析，处理结果均以X±SD表示，图表制作利用Excel 2003软件。

2 结果与分析

2.1 决明子不同提取液对魔芋粉中菌落总数抑制结果

对照组魔芋粉混悬液菌落总数为6.9×103CFU，乙醇提取液、蒸馏水浸提液对微生物的抑制率为100.0%，氯仿提取液对微生物的抑制率为82.9%，乙醇对照组对微生物的生长基本无抑制作用，氯仿对照组对微生物的抑制率为11.9%，水提取液对微生物的抑制率为58.0%。不同提取液对魔芋粉中菌落总数的抑制率见表1。

表1 不同提取液对魔芋粉中菌落总数的抑制率

2.2 决明子不同提取液对食源性致病菌抑菌圈大小试验结果

如表2所示，乙醇对照组、氯仿对照组、蒸馏水对照组，对7种食源性基本无抑菌效果，决明子乙醇提取液对食源性致病菌的抑菌效果显著高于决明子氯仿提取液、蒸馏水提取液、蒸馏水浸提液，枯草芽孢杆菌对决明子乙醇提取液高度敏感(抑菌圈直径>16mm)。

表2 不同提取液对食源性致病菌抑菌效果Table 2 Antibacterial effects of different extracts on food-borne pathogens

3 结论与讨论

蒸馏水提取液对微生物生长的抑制效果不如氯仿、乙醇提取液，而蒸馏水浸提液的抑菌效果却能与乙醇提取液抑菌效果达到一致，均为100%，原因可能是高温破坏了决明子中活性成分(生物碱、游离蒽醌、苷类等)的分子构造，进而导致抑菌能力下降，而乙醇的沸点为78℃，很好的保护了决明子中有效抑菌成分，使抑菌活性达到100%；氯仿提取液的抑菌能力不如乙醇提取液，说明氯仿能溶解萃取出决明子中有效抑菌物质的能力，不如乙醇。

决明子乙醇提取液对食源性致病菌的抑制效果，显著高于其它3种提取工艺提取出的决明子提取液，蒸馏水高温提取出的决明子提取液，只对枯草芽孢杆菌具有一定的抑菌效果，且抑菌效果较差，对其他致病菌基本无抑菌效果，这也说明高温会破坏决明子中有效抑菌活性物质，其它3种工艺萃取出的决明子提取液，只对金黄色葡萄球菌、铜绿假单抱杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特菌具有抑菌效果，说明决明子提取液只对革兰氏阳性菌具有抑菌作用，而对革兰氏阴性菌、真菌等抑菌效果较差。