链脲佐菌素诱导的糖尿病模型小鼠对炎症性关节炎的影响

刘莉玄，李莉，陈昱颖，胡星云，宋卫东，杨川*

糖尿病是一组主要特征为持续性高血糖状态的代谢性疾病。糖尿病足是糖尿病的主要慢性并发症之一，具有治疗困难、费用高昂、复发率较高，严重影响患者的生活质量。夏科氏神经关节病，又称夏科氏骨关节病，是由于糖尿病导致末梢神经病变后出现的骨和关节部位进行性发生的非感染性无痛性炎症破坏病变，严重影响关节周围软组织和骨骼，常导致关节退行性变和畸形［1，2］。夏科氏神经关节病是糖尿病足的发生病因之一，炎症性关节炎是夏科氏神经关节病的基础［3］。目前夏科氏神经关节病的发病机理并不十分清晰。

关节炎骨破坏机制复杂，其中细胞核因子κB受体活化因子配体（the receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）/细胞核因子κB受体活化因子（the receptor activator of NF-κB，RANK）/骨保护素（osteoprotegerin，OPG）通路在关节炎研究中起重要作用［4］。本研究以STZ诱导糖尿病模型、以胶原诱导关节炎模型，探讨糖尿病对CIA小鼠踝关节OPG、RANKL表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级C57BL/6J品系小鼠购于中山大学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2016-0029）；STZ购自Sigma-Aldrich公司，牛II型胶原、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂均购自Chondrex公司，DEPC水、RIPA、裂解液均购自碧云天公司，RNAiso Plus、逆转录试剂盒、qPCR试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒均购自TAKARA公司，引物由苏州泓迅生物科技公司合成。血糖仪及血糖试纸购自罗氏公司，冷冻组织研磨仪购自上海净信实业发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型 将16只6周龄雄性SPF级小鼠随机分成两组：单纯关节炎模型（CON+CIA）组和糖尿病关节炎模型（STZ+CIA）组，每组各8只。在6周龄时，糖尿病模型组小鼠在禁食12 h后一次性腹腔注射STZ 150 mg/kg，对照组予腹腔注射同等体积柠檬酸盐缓冲液。在7周龄时，将两组小鼠按以下方法诱导关节炎模型：全程在冰水浴中，将浓度为2 mg/kg的牛Ⅱ型胶原等体积（1∶1）加入到完全弗氏佐剂中，边加入边用电动匀浆器以12 000 rpm3 min，暂停1 min乳化，直至乳化剂滴入水中不扩散表明已充分乳化。在1 h内在每只小鼠后足足垫注射0.05 mL乳化剂。在21天后以同样方法制备牛Ⅱ型胶原（2 mg/kg）和不完全弗氏佐剂的乳化剂，予每只小鼠腹腔注射0.1 mL，加强免疫。从6周龄起至19周龄，每周禁食12 h后尾静脉取血，用血糖仪测量空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），以FBG＞16.7 mmol/L为小鼠糖尿病模型成功构建及维持。每周测量小鼠足趾厚度、全足容积、关节炎评分。并于19周龄时处死小鼠，留取踝关节组织提取RNA和蛋白质，用于后续RT-qPCR和Western blot实验。动物饲养于中山大学实验动物中心（北校园）（实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2017-0081），予标准饲料，自由饮水、进食。

1.2.2 小鼠足趾厚度测量 用电子游标卡尺测量小鼠双侧后足的足趾厚度，一端置于足底，一端置于足背最高处，左右足各测量3次，分别取平均值。

1.2.3 RT-qPCR检测OPG、RANKL基因mRNA的表达水平 将踝关节剪碎提取RNA，测量RNA浓度后逆转录500 ng cDNA，用qPCR检测基因mRNA的表达水平。qPCR反应条件如下，95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃延伸30 s，共45个循环。用βactin作为内参基因，用2-ΔΔCt分析基因相对表达量。引物序列见表1。

1.2.4 Western Blot检测OPG、RANKL蛋白表达水平 踝关节剪碎后提取总蛋白，使用一抗β-actin（Servicebio，GB11001，1∶2000）、OPG（abcam，ab203061，1∶600）、RANKL（Santa Cruz，sc-71747，1∶400）检测蛋白表达水平。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差表示，经正态性检验和方差齐性检验后采用独立两样本t检验进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 qPCR引物序列

2结果

2.1 链脲佐菌素诱导I型糖尿病模型

与CON+CIA组比较，STZ+CIA组注射STZ后第1周和第2至13周空腹血糖水平明显升高（FBG＞16.7 mmol/L），且差异具有统计学意义（P＜0.001），提示STZ诱导的糖尿病模型可以成功构建并维持（表2）（图1）。

表2 小鼠空腹血糖水平（mmol·L-1，n=8）

2.2 小鼠足趾厚度

胶原诱导关节炎模型后，CON+CIA组小鼠关节炎发展较快，且足趾更肿胀，在第2、3周时差异有统计学意义（P＜0.05）。（表3）（图2）

2.3 小鼠足趾照片

胶原诱导关节炎模型后，小鼠双侧后足均出现明显红、肿和关节运动障碍，与CIA组相比，STZ+CIA组小鼠关节红肿较小，但关节红肿持续时间较长。（图3）

图1 小鼠空腹血糖水平（mmol/L，n=8）

表3 小鼠足垫厚度（cm，n=8）

图2 小鼠足趾厚度（cm，n=8）

图3 小鼠足趾高峰期照片 左图：CON+CIA组小鼠足垫，3周；右图：STZ+CIA组小鼠足垫，3周

2.4 OPG、RANKL基因mRNA、蛋白质的表达水平

RT-qPCR结果显示，与CON+CIA组相比，STZ+CIA组小鼠关节组织中OPG、RANKL表达明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。且RANKL/OPG比值＞1，表明骨吸收过程显著高于骨生成过程。Western blot结果显示，与CON+CIA组相比，STZ+CIA组小鼠关节组织中OPG、RANKL表达明显升高。（图4）

图4 糖尿病模型对关节炎小鼠踝组织中OPG、RANKL基因mRNA和蛋白质的影响

3 讨论

本研究采用一次性腹腔注射链脲佐菌素复制Ⅰ型糖尿病模型［5］，STZ可以破坏小鼠胰岛细胞，导致胰岛素分泌减少，外周血糖升高，且在研究期间血糖持续升高，以确认糖尿病模型成功建立；以Ⅱ型胶原诱导关节炎模型［6］，导致小鼠踝关节和足部出现不同程度红、肿、关节运动障碍。通过用游标卡尺测量足趾厚度发现，与STZ+CIA组比较，CON+CIA组关节炎发展较快且肿胀程度更严重，但其缓解也更快，考虑小鼠糖尿病模型延缓了关节炎模型的发展，延长了关节炎的病程。通过对踝关节进行RANKL、OPG的表达水平的检测发现，与CON+CIA组比较，STZ+CIA组RANKL、OPG表达均上调，且RANKL/OPG比值上调，说明糖尿病模型小鼠虽然关节肿胀程度虽然较轻，其组织中骨吸收过程较非糖尿病小鼠更严重，骨损伤更大。

RANKL/RANK/OPG通路不仅是调控骨代谢的重要通路之一，还是调节促炎因子和抗炎因子的重要通路之一［7］。在骨代谢中，它通过对破骨细胞的调控起作用。成骨细胞表达的RANKL可以与破骨细胞表面的RANK结合，进一步促进破骨细胞分化成熟，造成骨吸收；而成骨细胞还可以分泌可溶性分泌蛋白OPG，OPG属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族成员，可以竞争性结合RANKL，以抑制RANKL和RANK的结合，从而限制破骨细胞活跃导致的过度骨吸收［8-10］。因此，OPG和RANKL的稳定表达对骨代谢起重要作用，RANKL/OPG比值对骨骼完整性起重要影响因素。

综上，在关节炎模型小鼠中，虽然非糖尿病小鼠的关节炎发展更快、肿胀程度更严重，而糖尿病小鼠关节炎持续时间更长，且骨吸收过程更严重。但具体机制有待进一步探究。