肝癌患者中RNF24的表达及临床价值

伍隽华，陈云扬，张鑫，余杰雄，崔恩铭，张慧玲

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，全世界范围内常见的致死肿瘤之一［1］。随着现代科学技术的发展，越来越多的检查方法与筛查手段被挖掘。然而，肝癌的早期检出率及患者的预后仍不尽如人意，有关研究、探索依然有很大的空间［2，3］。为进一步做好肝癌的早期筛查及精准防治工作，新型肿瘤标记物的发现至关重要。RNF24是一种定位于高尔基体膜中新型膜蛋白，该蛋白含有锌指结构，可与瞬时受体电位阳离子通道蛋白6（TRPC6）的锚蛋白样重复结构域相互作用并影响TRPC细胞内运输［4］。我们前期生信筛查提示，较癌旁组织而言，RNF24在肝癌组织中呈高表达趋势。当前，RNF24在肿瘤（包括肝癌）中作用罕有研究报道，RNF24在肝癌发生、发展中扮演什么角色仍不清楚。本研究拟借助大数据时代提供的机遇，利用公共数据资源、探讨RNF24在肝癌中表达及其对肝癌患者预后的影响。同时，通过分析RNF24与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系，探究RNF24在肝癌中发挥作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 数据收集

从Firebrowse网站下载具有完整临床信息（包含生存信息）的肝癌患者RNA-seq数据205例，其中男性患者135例，女性患者70例。根据操作说明解码数据，进行后续分析。

1.2 临床指标选择

结合数据库提供临床参数的实际情况，经过专家筛选，本研究纳入了患者性别、年龄、体重、白蛋白水平、甲胎蛋白（AFP）水平、血小板、凝血酶原时间、胆红素、肿瘤分级、血管侵犯、肿瘤重量及肿瘤坏死百分比等临床指标，进行患者预后分析。

1.3 RNF24 mRNA在肝癌中的表达

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）是一个在线工具，主要包含各种不同类型的肿瘤患者RNAseq数据［5］。本文利用此平台分析RNF24基因表达水平及其与肝癌患者临床特征之间的关系。

1.4 RNF24蛋白在肝癌中的表达

HPA数据库（https：//www.proteinatlas.org）包含近20种不同肿瘤的基因表达信息［6］。本研究使用该工具评估正常组织和癌组织中RNF24蛋白质表达水平。分析过程由两人独立进行，并通过Image J软件进行定量分析。

1.5 RNF24与免疫细胞浸润的相关性

TIMER数 据 库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是肿瘤免疫研究经典数据库，用于分析各种癌症中基因表达与免疫细胞浸润之间的相关性［7］。本研究分析了肝癌患者RNF24表达与B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞浸润之间的关系。同时，我们采用多变量Cox分析探讨常见临床指标、浸润免疫细胞亚群及RNF24表达对患者预后的影响。

1.6 RNF24对肝癌患者预后的影响

Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com/analysis/）平台是一个经典的生存分析工具［8］。本项研究分析了RNF24在364例肝癌症患者的总生存期（OS）、无进展生存期（PFS）、无复发生存期（RFS）及疾病特异性生存期（DSS），预测RNF24在肝癌患者预后中的价值。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，两组数据比较采用t检验。采用多变量Cox分析探讨RNF24、免疫浸润及常见临床指标对预后的影响；采用单变量/多变量Cox比例风险回归模型确定RNF24表达与患者生存率的关系；采用Kaplan-Meier法评估RNF24对肝癌患者生存的影响。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNF24在肝癌中表达及与肿瘤分期、分级的关系

UALCAN数据库检测RNF24 mRNA在肝癌中表达量中位值（median，M）为0.712（q1=0.376，q3=1.287），明显高于正常肝组织中位值0.265（q1=0.17，q3=0.371）（P＜0.01；图1A）。进一步，我们分析RNF24表达水平与肝癌分级、临床分期之间的关系，结果表明随着肿瘤中RNF24表达水平的升高，患者临床分期、肿瘤分级越差（图1B、1C）。最后，我们利用HPA数据资源发现RNF24在肝癌组织中蛋白表达水平比对应正常肝组织高（图1D、1E、1F）。

2.2 RNF24在肝癌中表达与免疫细胞浸润的关系

利用TIMER数据库探究RNF24与免疫细胞浸润之间的相关性，我们发现B淋巴细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及树突状细胞的浸润水平与RNF24水平呈正相关（图2A，所有P＜0.05）。进一步，使用多变量Cox分析来探究免疫细胞浸润、常见临床指标及RNF24表达水平对肝癌患者预后的影响。结果显示，肿瘤分期、CD8+T细胞和树突状细胞浸润以及RNF24表达都是影响肝癌预后的影响因素。并且，尽管RNF24表达对肝癌患者1年生存期无显著影响，但RNF24是患者3年、5年生存期的危险因素（表1；图2B、2C、2D）。

图1 RNF24在肝癌中表达谱及与肿瘤临床分期、分级的关系 图A：RNF24在TCGA的表达情况（UALCAN）；图B：RNF24表达与肝癌肿瘤分期的关系（UALCAN）；图C：RNF24表达与肝癌肿瘤分级的关系（UALCAN）；图D～F：RNF24在肝癌中的蛋白表达情况（HPA）

表1 336例肝癌患者免疫浸润、RNF24表达及常见临床指标对患者预后的Cox分析

2.3 RNF24对患者临床预后的影响

通过Kaplan-Meier生存分析，我们发现RNF24表达水平越高的肝癌患者总体生存率越短（HR=2，95%CI：1.42～2.84；P=6.3e-5；图3A）。进一步分析PFS，RFS和DSS时，我们发现类似的结果（图3B、3C、3D），这些结果均表明RNF24高表达与肝癌患者的不良预后显著相关。

图2 肝癌中RNF24表达与免疫浸润的相关性 图A：RNF24表达与免疫细胞浸润之间的相关性；图B～D：免疫浸润、RNF24表达对肝癌患者1年、3年和5年生存期的影响

图3 RNF24对患者生存的影响 图A：总体生存期（OS）；图B：无进展生存期（PFS）；图C：无复发生存期（RFS）；图D：疾病特异性生存期（DSS）

2.4 RNF24是肝癌患者预后的独立危险因素

从Firebrowse网站下载RNF24表达和对应患者临床信息数据，经过两位专家独立筛查，我们纳入了具有完整信息的205例肝癌患者、12个常见临床指标进行单因素与多因素Cox回归分析。患者临床信息见表2。单因素与多因素Cox回归分析结果见表3，结果显示在单因素分析中，总胆红素（TB）水平（HR=21.354，95%CI：5.942～76.743，P＜0.001），肿瘤重量（HR=1.001，95%CI：1.000～1.001，P＜0.001）和RNF24表达水平（HR=1.003，95%CI：1.000～1.005，P=0.011）为患者总体存活率（OS）的危险因素；多因素分析结果提示，总胆红素水平、肿瘤重量及RNF24表达水平与患者总体生存率显著相关。

表3 205例肝癌患者Cox生存分析

3 讨论

RNF（RINGFinger）蛋白是一类包含环指基序的锌指蛋白，可以结合E3泛素化酶及其底物，起连接酶的作用，促进目标蛋白的降解［9］。研究表明，RNF在调节细胞分化，生长和转化中起着重要作用，RNF的异常表达亦可导致某些肿瘤的发生、发展［10］。RNF24作为家族中重要的一员，其在生命活动调节中所起的作用也备受关注。Lussier等［4］在研究中指出，RNF24与高尔基体中的TRPC相互作用并影响TRPC胞内运输，但不会影响其活性。然而，RNF24在肝癌中的作用没有报道，其内在机制仍有待探究。

本研究利用信息时代提供的契机，通过挖掘数据库中RNF24基因在肝癌中的表达及作用的有关信息，充分利用数据资源。我们的研究结果表明，无论从mRNA水平还是蛋白质水平，RNF24基因在肝癌组织中的表达显著高于在正常肝组织中的表达。同时，临床资料分析结果提示高表达的RNF24与肝癌患者临床分期、肿瘤分级显著相关，这也提示了RNF24在肝癌患者中可能作为一种预后不良预测因子。进一步，我们检测了RNF24水平与免疫浸润细胞的相关性，肿瘤微环境中免疫细胞浸润已被证明是多种癌症的预后影响因素［11，12］。本研究显示RNF24水平与某些免疫细胞浸润相关，但肿瘤微环境中的免疫细胞如何影响RNF24的表达，促进肝癌的生长、进展，尚需进一步研究。最后，本研究利用Kaplan-Meier生存数据库分析，结果提示RNF24高表达的肝癌患者生存期更短。单因素及多因素Cox回归分析表明RNF24高表达是肝癌患者预后的独立危险因素。

综上，RNF24基因可能通过影响肿瘤微环境中的免疫细胞的组成及比例影响肝癌患者的预后。RNF24在肝癌的发生、发展中扮演重要角色，有望成为肝癌患者预后预测的一种新型标记物。深入研究其发挥作用的内在机理，未来可为肝癌的精准防治提供新的思路。