PDIA4基因沉默对胶质瘤细胞凋亡的影响

朱传华，谢琳，刘安民

胶质瘤是神经中枢系统最常见的原发恶性肿瘤，且传统手术、化疗、放疗及目前已有的靶向治疗对胶质瘤的治疗效果不佳。目前对于胶质瘤的病因仍不清楚，因此探讨其发病机制对于胶质瘤的诊疗具有重要意义［1］。蛋白二硫键异构酶家族成员4（protein disulfide isomerase family a member 4，PDIA4）定位于细胞内质网发挥功能，参与蛋白质折叠、硫醇-二硫键交换反应和内质网应激反应。近些年来越来越多研究表明，PDIA4基因是肿瘤诊断和治疗的潜在靶标［2］，但其在胶质瘤发生发展中的作用机制不明。本研究利用RNAi技术沉默PDIA4表达，探索其对胶质瘤增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

人胶质瘤细胞系U251、U87、HA1800由中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心提供。DMEM高糖培养基、胎牛血清、细胞用青霉素/链霉素和EDTA胰酶购自美国Gibco公司；星形胶质细胞培养基购自ScienCell公司；alarma blue试剂购于Sigma公司；LipofectamineTM3000、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自美国Invitrogen公司；RNA-Quick Purification Kit购自上海奕杉生物；cDNA Synthesis SuperMix和SYBR Green Master Mix购自上海翊圣生物；4%多聚甲醛、结晶紫染液购自上海碧云天生物技术有限公司；蛋白提取RIPA裂解液购自康为世纪公司；cleaved-caspase-3、cleavedcaspase-7单克隆抗体、羊抗兔二抗购自CST公司。引物由苏州泓迅生物科技公司合成，靶向PDIA4的小干扰RNA及阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司，siRNA序列：si-PDIA4#768 5′-GCAAGCGUUCUCCUCCAAUTT-3′，si-PDIA4#1829 5′-GCCUGGUCAUCGCCAAGAUTT-3′，siNC 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

1.2 CGGA数据库分析

从CGGA（中国脑胶质瘤基因组图谱计划）网 站（http：//cgga.org.cn/）下 载mRNAseq_693［3］和mRNAseq_325［4］的RNAseq数据及相应临床数据，使用R语言的“sva”和“limma”包进行批次校正，应用kruskal检验分析基因表达量和肿瘤级别的相关性，利用“survival”和“survminer”u语言包进行生存分析并作图，基因高表达组和低表达组通过中位值划分。

1.3 细胞培养

将胶质瘤细胞U87和U251与正常星形胶质细胞HA1800于培养箱（37℃恒温，5%CO2）中培养，U87和U251使用含100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，HA1800使用星形胶质细胞培养基。每3 d消化传代一次。

1.4 RT-qPCR法检测胶质瘤细胞的PDIA4表达

将各组细胞抽提总RNA，按试剂盒说明书逆转录，获得的cDNA稀释10倍后作为模板，以GAPDH为内参，按照qPCR试剂说明书指示在BIO-RAD实时荧光定量PCR仪进行qPCR检测。PCR引物序列：

qPCR反应条件：95℃30 s；95℃5 s、60℃30 s，共40个循环。RT-qPCR的结果以2-△△Ct表示目的基因mRNA的相对表达量，△△Ct=（处理组Ct靶基因-处理组CtGAPDH）-（阴性对照组Ct靶基因-阴性对照组CtGAPDH）。

1.5 细胞转染

将5×104个/孔数目的细胞接种在6孔板上，待细胞融合度达到70%时，按照转染试剂说明书转染细胞。将未转染细胞、转染siNC、转染siPDIA4 768、转染siPDIA4 1829的细胞分别称为：空白组、阴性对照组、si#768组和si#1829组。

1.6 蛋白免疫印记实验检测细胞蛋白水平

收集各组转染48 h后的细胞，使用RIPA裂解液冰上裂解15 min，离心后取上清使用BCA试剂盒蛋白定量，校准蛋白浓度后与蛋白上样缓冲液混匀于100℃孵育10 min，凝胶电泳后通过电泳转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，加一抗（1∶1000）于4℃孵育过夜；TBST洗膜后加二抗（1∶5000）室温孵育1 h，TBST洗膜后用ECL荧光发光试剂盒显影，凝胶成像系统拍摄分析，使用Image J软件分析条带灰度值。

1.7 阿尔玛蓝（alarma blue）实验检测胶质瘤细胞的增殖能力

收集转染8 h后的细胞，以2×103个/孔的细胞密度分别接种于96孔平底细胞培养板中。细胞分别继续培养1 d、3 d、5 d后用每孔换alarma blue工作液100μL，37℃细胞培养箱孵育1 h后，在酶标仪上检测吸收波长530 nm，发射波长590 nm的荧光强度。

1.8 克隆形成实验检测细胞克隆集落形成数目

收集转染8 h后的细胞，以2×103个/孔的细胞密度分别接种于6孔细胞培养板中，细胞培养14 d后，4%多聚甲醛溶液固定15 min，500μL结晶紫染液染色15 min，清洗烘干后拍照计数。

1.9 流式细胞术检测细胞凋亡率

各组细胞转染24 h后换完全培养基培养48 h，收集细胞和上清，PBS重悬后离心收集细胞，用含5μL Annexin V-FITC和10μL PI染料的凋亡染色缓冲液重悬细胞，室温避光孵育20 min，流式上机检测FITC和PI通道相应的信号值。

1.10 统计学方法

以上所有实验均重复3次。使用Graphpad Prism 8.0及SPSS 25.0对实验数据进行统计分析和图片绘图。数据用均数±标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，两组之间比较采用t检验，生存分析应用Log-rank检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CGGA数据分析验证PDIA4基因与胶质瘤级别和不良预后相关

PDIA4表达水平在WHOⅡ-Ⅳ级胶质瘤中分别为4.37±0.77、4.80±0.83和5.60±0.94，差异有统计学意义（F=140.58，P＜0.05），kruskal检验分析PDIA4表达量和胶质瘤级别的具有相关性（P＜0.05）。用LSD-t法进行两两比较WHOⅡ级与WHOⅢ级相比、WHOⅢ级与WHOⅣ相比（均P＜0.05），差异有统计学意义（图1A）。Kaplan-Meier生存分析PDIA4高表达组5年生存率16.23%，PDIA4低表达组60.20%，Log-rank检验（Log-rank=264.32，P＜0.001），两组生存差异有统计学意义（图1B）。

图1 CGGA胶质瘤数据中PDIA4的表达水平与胶质瘤级别和总体生存期的关系 A：各级别胶质瘤PDIA4的表达水平；B：PDIA4高表达和低表达组的总生存曲线

2.2 在胶质瘤细胞系中验证PDIA4表达差异

胶质瘤细胞株U251和U87相对于正常星形胶质细胞株HA1800的2-△△Ct值分别是3.03±0.38和1.87±8.35，差异具有统计学意义（F=58.44，P＜0.05）。多重比较显示，U251和U87的PDIA4表达水平均高于HA1800（均P＜0.05），且U251要高于U87（P＜0.05），故选择U251进行后续实验。

2.3 PDIA4沉默效果验证

相比于空白组和阴性对照组，si#768组和si#1829组细胞PDIA4蛋白表达量降低（F=92.63，P＜0.001）（图2，表1），差异有统计学意义。多重比较显示si#768组和si#1829组的PDIA4蛋白表达量均低于空白组和对照组（均P＜0.001），且si#768组和si#1829组之间，空白组和阴性对照组之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图2 蛋白免疫印记实验检测siRNA沉默效果

表1 PDIA4在细胞株中敲降效果验证（n=3）

2.4 沉默PDIA4抑制胶质瘤细胞增殖

si#768组和si#1829组细胞增殖速度均低于空白组和阴性对照组（图3），第5d各组的荧光强度：空白组（300.00±4.53）、阴性对照组（282.33±2.71）、si#768组（108.67±8.45）、si#1829组（42.00±.0.65）（F=487.59，P＜0.01）。多重比较显示si#768组和si#1829组的荧光强度均低于空白组和对照组（均P＜0.01），且空白组和阴性对照组之间的差异无统计学意义（P＞0.05），si#768组和si#1829组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 沉默PDIA4抑制胶质瘤细胞克隆集落形成

si#768组（158.00±55.15）和si#1829组（110.50±11.92）的克隆集落形成数目明显低于空白组（393.00±96.15）和阴性对照组（382.50±82.84）（F=49.34，P＜0.05），差异具有统计学意义（图4A，B）。多重比较显示si#768组和si#1829组的克隆集落形成数目均低于空白组和对照组（均P＜0.001），且si#768组和si#1829组之间，空白组和阴性对照组之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图3 阿尔玛蓝实验检测各组细胞的增殖水平 与空白组和阴性对照组比较，**P＜0.01，***P＜0.001）

2.6 沉默PDIA4促进胶质瘤细胞凋亡

空白组、阴性对照组、si#768组和si#1829组凋亡率分别为（3.72±7.11）%、（6.53±0.13）%、（7.67±0.11）%、（19.50±9.30）%，si#768组和si#1829组细胞凋亡比例高于空白组和阴性对照组（F=51.06，P＜0.05），差异具有统计学意义（图5）。多重比较显示si#768组和si#1829组的细胞凋亡比例均高于空白组和对照组（均P＜0.05），且si#768组和si#1829组之间，空白组和阴性对照组之间的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

图4 克隆形成实验检测各组细胞克隆形成能力 A：各组细胞克隆集落扫描图；B：各组细胞克隆形成集落计数统计图（mean±SD，n=3，**与空白组和阴性对照组比较，P＜0.01，***与空白组和阴性对照组比较，P＜0.001）

图5 流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况

2.7 沉默PDIA4后Caspase通路激活

相比于阴性对照组，si#768组和si#1829组cleaved-caspase 3、cleaved-caspase 7表达量均有升高（图6，表2），cleaved-caspase 3表达水平差异有统计学意义（F=19.58，P＜0.05），cleaved-caspase7表达水平差异有统计学意义（F=12.61，P＜0.05）。多重比较显示，si#768组和si#1829组cleaved-caspase 3和cleaved-caspase 7表达水平均高于阴性对照组（均P＜0.05），差异有统计学意义。

图6 蛋白免疫印迹实验检测各组细胞凋亡相关蛋白表达情况

表2 不同处理组凋亡相关蛋白相对表达量（n=3）

3 讨论

本研究分析CGGA数据库，发现PDIA4表达水平胶质瘤级别相关，且其表达水平越高，患者预后越差，这与先前研究报道的结果相符［5］。胶质瘤的发生是一个多因素参与的病理过程，因其分子机制多样性［6］，导致治疗和预后不理想。作为在多种肿瘤中均高表达的蛋白，PDIA4能发挥分子伴侣的功能［7］，促进蛋白质合成，这恰是肿瘤细胞快速增殖所需要的，提示PDIA4在肿瘤的发生和发展中可能具有重要作用。后续实验发现PDIA4在胶质瘤细胞中高表达，表明PDIA4可能是胶质瘤的特异性分子标记物。

进一步研究PDIA4在胶质瘤中发挥的功能，通过siRNA沉默胶质瘤细胞的PDIA4表达后，观察到细胞增殖减慢，Yao等［8］在卵巢癌研究发现类似的现象，表明PDIA4高表达是胶质瘤细胞快速增殖所需要的。有研究证实PDIA4是前列腺癌细胞凋亡的负调控因子［9］，我们的研究发现沉默PDIA4的胶质瘤细胞凋亡比例升高，这提示PDIA4可能也参与了胶质瘤细胞凋亡进程。

细胞凋亡是细胞在多种基因调控下，用于维持细胞稳态的程序性自杀模式［10］。为进一步探索下游机制，检测发现实验组的cleaved-caspase 3、cleavedcaspase 7表达均有升高，而caspase 3和caspase 7是经典凋亡通路的观察指标，作为细胞凋亡的主要执行者，需要通过蛋白水解形成剪切体发挥功能，启动细胞凋亡。由此推测，沉默PDIA4可能通过激活caspase通路来促进胶质瘤细胞凋亡。

综上所述，沉默PDIA4可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖，促进细胞凋亡，其机制可能是通过激活caspase通路，但是对于否有其他信号通路参与仍需要进行更深入的研究。同时本研究仍存在明显的不足：首先实验仅进行了沉默PDIA4，没有进行过表达实验，也未在正常胶质细胞中进行实验，难以明确基因基本功能；其次，仅在数据库和细胞水平对该基因进行功能探索，缺少确实的临床数据和动物实验，未来的研究需要对其进一步的完善。