四逆汤对肢体闭塞性动脉硬化患者血管内皮细胞功能的影响

方豫东 范雨心 刘 哲 周 颖 张仲梁 杨沁彤

上海中医药大学附属上海市中西医结合医院脉管科，上海 200082

肢体闭塞性动脉硬化（arteriosclerosis obliterans，ASO）是常见的外周动脉闭塞性疾病，是周围大中动脉管壁发生狭窄或闭塞，从而引起肢体出现缺血症状的疾病，其基本的病理变化是动脉粥样硬化。ASO轻者可发生肢体慢性缺血、远端供血不足，重者可发生肢端溃疡、坏死、趾节脱落，致残率、致死率均较高，严重影响生活质量。ASO的发病机制复杂，血管内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化形成的始动环节[1]。病变初期，多种因素反复刺激内皮细胞，造成内皮细胞受损，血液中所携带的脂质易渗入血管壁，单核细胞被多种因子激活并进入内膜转变为巨噬细胞，可通过吞噬大量脂质并降解为泡沫细胞，泡沫细胞是动脉粥样硬化早期病变的特征。因此，保护内皮细胞功能是早期防治动脉硬化的关键[2]。中医学将ASO归为“脱疽”的范畴。历代医家多认为本病属本虚标实证，阳虚为本，寒凝痰瘀为标，故治疗应以扶阳温阳为本。四逆汤出自张仲景的《伤寒论》，为扶阳第一要方。现代药理学研究表明，四逆汤具有保护血管内皮功能、消除炎性反应、减少氧化应激反应、扩张血管及调节信号通路等药理作用，对动脉粥样硬化有良好的治疗效果[3]。本研究旨在探讨四逆汤对ASO患者血清网膜素、脂联素、瘦素、一氧化氮（nitric oxide，NO）、内皮素-1（endothelin-1，ET-1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等血管内皮细胞功能指标的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年1月至2020年12月上海中医药大学附属上海市中西医结合医院收治的ASO患者的临床资料。纳入标准：（1）符合《动脉硬化闭塞症诊断及疗效标准（2016年修订稿）》[4]中关于ASO的西医及中医血脉瘀阻证的诊断标准；（2）50～75岁；（3）临床分期为Ⅰ、Ⅱ期。排除标准：（1）合并严重的下肢感染，病情危重；（2）合并严重的心脑血管、肝、肾、消化系统和造血系统等原发性疾病；（3）合并免疫性疾病及精神类疾病。（4）有影响研究开展的相关复杂化病史；（5）治疗依从性差，不能按照医嘱完成治疗疗程；（6）正在参与其他药物临床研究的受试者。根据纳入与排除标准，共纳入144例ASO患者，根据治疗方式的不同分为治疗组和对照组，每组72例。治疗组中，男性44例，女性28例；年龄50～74岁，平均（65.3±4.6）岁。对照组中，男性40例，女性32例；年龄55～75岁，平均（66.1±5.5）岁。两组患者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法

两组患者均接受西医常规治疗：贝前列素钠片20 μg，口服，每日3次，每次2片；阿司匹林片0.1 g，口服，每日1次，每次1片；瑞舒伐他汀钙片10 mg口服，每日1次，每次1片。对照组患者在西医常规治疗的基础上加用血府逐瘀汤治疗。药物组方：桃仁6 g，红花6 g，当归9 g，生地黄9 g，牛膝9 g，川芎6 g，桔梗6 g，赤芍6 g，枳壳9 g，甘草6 g，柴胡6 g。水煎取汁400 ml，每日1剂，早晚分服。治疗组患者在西医常规治疗的基础上加用四逆汤治疗。药物组方：附子15 g，干姜6 g，甘草6 g。水煎取汁400 ml，每日1剂，早晚分服。两组患者均以28 d为1个疗程，共治疗1个疗程。治疗过程中，所有患者均接受常规指导，饮食清淡，忌烟忌酒。

1.3 观察指标

（1）根据《动脉硬化闭塞症诊断及疗效标准（2016年修订稿）》[4]对两组患者的症状进行评分，指标包括皮肤温度感、皮肤色泽、疼痛、间歇性跛行距离、间歇性跛行缓解时间、踝肱指数（ankle brachial index，ABI）。每项症状按照由轻到重的顺序分为6级，以0、2、4、6、8、10分计分。观察两组患者治疗期间的不良反应发生情况。参照尼莫地平法计算证候积分的减少率。证候积分减少率M＝［（治疗前主症总积分－治疗后主症总积分）/治疗前总积分］×100%。根据证候积分减少率对两组患者的中医疗效进行评定：痊愈，临床症状、体征消失或基本消失，证候积分减少率≥90%；显效，临床症状、体征明显改善，70%≤证候积分减少率＜90%；有效，临床症状、体征均有好转，30%≤证候积分减少率＜70%；无效，临床症状、体征无明显改善，甚至加重，证候积分减少率＜30%。临床总有效率＝（痊愈＋显效）例数/总例数×100%。（2）比较两组患者治疗前后的相关实验室指标，包括血管内皮细胞功能指标（NO、ET-1）、脂肪因子（血清网膜素、脂联素、瘦素）、炎性因子（IL-6、TNF-α）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料以n（%）表示，组间比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗完成情况

治疗组中，1例患者于治疗过程中不能坚持用药，1例患者无法按时进行门诊随访及治疗。对照组中1例患者治疗过程中不能坚持用药。

2.2 临床疗效的比较

治疗组中，痊愈10例，显效45例，有效6例，无效9例。对照组中，痊愈5例，显效36例，有效16例，无效14例。治疗组患者的总有效率为78.57%（55/70），高于对照组患者的57.75%（41/71），差异有统计学意义（χ2＝7.035，P＝0.008）。

2.3 血清网膜素、脂联素及瘦素水平的比较

治疗前，两组患者的血清网膜素、脂联素、瘦素水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组患者的血清网膜素、脂联素水平均高于本组治疗前，瘦素水平均低于本组治疗前，差异均有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，治疗组患者的血清网膜素、脂联素水平均高于对照组患者，瘦素水平低于对照组患者，差异均有统计学意义（t＝5.178、2.002、2.048，P＜0.05）。（表1）

2.4 IL-6、TNF-α水平的比较

治疗前，两组患者的IL-6、TNF-α水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组患者的IL-6、TNF-α水平均低于本组治疗前，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，治疗组患者的IL-6、TNF-α水平均低于对照组患者，差异有统计学意义（t＝7.932、2.370，P＜0.05）。（表2）

2.5 NO、ET-1水平的比较

治疗前，两组患者的NO、ET-1水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，两组患者的NO水平均高于本组干预前，ET-1水平均低于本组干预前，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗后，治疗组患者的NO水平高于对照组患者，ET-1水平低于对照组患者，差异均有统计学意义（t＝2.529、2.122，P＜0.05）。（表3）

表3 治疗前后两组患者NO、ET-1水平的比较（x±s）

2.6 不良反应发生情况

所有患者治疗前后的血常规及肝肾功能均未见异常，均未出现出血事件以及心脑血管意外，均未发生药物相关不良反应（肝肾功能异常、头晕、头痛、胃肠道反应等）。

3 讨论

目前，临床上对ASO的发病机制尚未完全阐明。研究表明，ASO的发病与血管内皮损伤、炎性细胞浸润、脂质渗入、血栓形成、平滑肌细胞增殖等因素有关，其中，血管内皮细胞功能障碍和炎性反应被激活是ASO发生、发展的基本环节[5]。当血管内皮细胞的功能出现障碍时，通透性屏障被破坏，且分泌功能受阻，可促进脂质向内膜下沉积，巨噬细胞吞噬脂质发展为泡沫细胞，进一步引发动脉硬化病变。NO是一种内源性合成血管舒张因子，是内皮细胞功能障碍的关键标志物[6]，当血管内皮细胞功能发生障碍时，NO的生成与释放减少，除了加速血小板的聚集与黏附外，还刺激内皮细胞生成过多的ET-1[7]。ET-1是一种效应很强的缩血管多肽，具有强烈的收缩血管的作用，是内皮细胞活跃与损伤的标志。当血管内皮细胞功能受损时，NO与ET-1的失衡可导致血管舒张、收缩功能异常，内皮细胞渗透性增加，IL-6、TNF-α等炎性因子生成，最终导致斑块形成[8]。本研究发现，与对照组相比，治疗后，两组患者的ET-1水平降低，NO水平升高，提示四逆汤可能是通过改善内皮细胞功能发挥舒张血管、改善外周动脉血供的作用。

炎性反应的激活与内皮细胞功能的损害密切相关，炎性因子通过损伤血管内皮使单核细胞向内膜迁移，促进斑块形成。IL-6由单核细胞、巨噬细胞等生成，可加速脂质沉积，调节黏附因子及细胞因子的表达，促进炎性反应的发生，从而形成血管粥样硬化斑块。此外，IL-6刺激肝脏合成并分泌大量的CRP。CRP不仅是血脂紊乱的独立危险因子，还是体内重要的炎性介质。TNF-α是由脂肪细胞和巨噬细胞生成的促炎细胞因子，TNF-α能够诱导单核细胞黏附并向内皮下间隙转移，导致平滑肌源及巨噬细胞源性泡沫细胞形成，对血管内皮细胞造成直接损伤[9]；TNF-α还能够诱导IL-6生成并促进单核细胞的黏附，导致血管粥样硬化斑块的形成[10]。本研究结果显示，治疗后，两组患者的IL-6、TNF-α水平均低于本组治疗前，且治疗组患者的IL-6、TNF-α水平均低于对照组患者，提示四逆汤具有一定的抑制血管炎性反应的作用。

脂肪组织不仅是能量贮备器官，还是重要的内分泌器官，其分泌的脂肪因子可作用于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及巨噬细胞，进而参与动脉粥样硬化病变的发生[11]。脂肪因子根据其功能可分为促炎因子和抗炎因子。网膜素是特异性表达于网膜脂肪组织的细胞因子，能够抑制机械性损伤引起的细胞增殖和血管内膜增生。研究表明，血清网膜素在内皮细胞中不仅能够通过影响NO引起血管舒张，还可抑制TNF-α介导的黏附因子的表达及单核细胞对平滑肌细胞的黏附作用[12]。瘦素是由白色脂肪组织分泌的蛋白类激素，不仅通过炎性介质的调节能诱导氧化应激反应和炎性反应，从而损伤内皮细胞，还可通过促进内皮素的分泌，促进血管平滑肌的分裂和增生，导致内皮细胞功能紊乱[13]。脂联素是由脂肪细胞产生的内源性生物活性多肽，可通过抑制巨噬细胞的吞噬活性控制早期炎性反应；脂联素还可通过NF-κB途径，抑制内皮细胞NF-κB信号，降低巨噬细胞中脂多糖诱导的TNF-α、IL-6的表达和释放，减少抗炎因子的表达[14]；还可增加血管对内皮生长因子的敏感性，并防止血管内皮细胞凋亡；同时抑制泡沫细胞的形成及平滑肌细胞的增殖，最终抑制动脉粥样硬化的进展。本研究发现，治疗后，两组患者的抗炎因子血清网膜素、脂联素水平升高，促炎因子瘦素水平下降，治疗组患者的脂肪因子改善情况优于对照组，进一步提示四逆汤具有较强的抑制血管炎性反应、减少血管内皮损伤的作用。

ASO属于祖国医学“脱疽”的范畴，历代医家认为其多与气虚血瘀、痰浊凝滞有关[15-16]。著名中西医结合脉管病专家奚九一教授认为，肢体ASO患者多为老年患者，阳气亏虚、脏腑功能失调是主要发病因素。脾肾阳虚，水失健运，湿浊不化，炼液为痰，痰湿凝滞，瘀滞脉道，四末失荣，肢端苍白、寒凉、冷痛等诸症丛生而发病，治疗当以扶阳温阳为要，直取病之所在。

四逆汤是扶阳第一要方，药简力专，配伍精当，由附子、甘草、干姜组成。四逆汤源于张仲景的《伤寒论》，为寒入少阴证所设，有回阳救逆之效[17]。爪甲青黑、四肢逆冷、身重畏寒、脉微欲绝之侯等ASO常见的临床表现与四逆汤的主治证型相符。方中的附子辛、甘、大热，为君药补先天欲绝之火种，有回阳救逆、散寒止痛之效；干姜温热，驱荡阴邪，迎阳归舍，协助附子发挥中药相使的作用；甘草缓伏真火，使命根永固，诸药合用共奏扶阳化气通络之功，虽然非活血却有化瘀之效。现代药理学认为，附子含有多种生物碱，其主要成分为生物碱、黄酮、皂苷等。据文献报道，占主要部分的乌头碱类化合物不仅具有明显的扩张血管作用[18]，还具有强心、抗心律失常、镇痛、抗炎等药理作用。干姜中的化学成分主要是挥发油、姜辣素和二苯基庚烷类等化合物，其中，姜酚类化合物具有明显的抗炎作用；挥发油等成分可促进局部血液循环。研究还发现，干姜水提物和挥发油具有预防血栓形成及抑制血小板聚集的作用[19]。甘草含有甘草总黄酮、甘草酸、甘草次酸、三萜类、甘草苷等成分，其中，三萜皂苷类化合物是甘草的特异性标志成分，其中含量最高的甘草酸具有抗炎、抗过敏、抑制TNF-α释放、抗氧化等作用[20]。

综上所述，四逆汤能明显改善ASO患者的肢体缺血症状，具有较强的扩张血管、抑制血管炎性反应的作用，其机制可能与升高血清抗炎因子水平、降低血清炎性因子水平、改善血管内皮细胞功能有关。进一步研究血管内皮细胞损伤的机制可为ASO的预防和治疗提供更多依据。