miR-199b-5p在2型乳头状肾细胞癌合并下腔静脉瘤栓中的表达及功能
2021-06-15丁振山周晓峰马潞林
丁振山,周晓峰,马潞林
(1.北京大学第三医院 泌尿外科,北京 100191;2.中日友好医院 泌尿外科,北京 100029)
肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一,占成年人所有恶性肿瘤的2%~3%[1]。根据肿瘤组织细胞的形态学特点,结合基因改变和肿瘤的起源可将肾细胞癌分为多种亚型。其中,乳头状肾细胞癌(papillary renal cell carcinoma,PRCC)是仅次于透明细胞癌的第二大肾细胞癌亚型,占全部肾细胞癌15%~20%[2]。根据细胞及结构特征,将PRCC 分为1 型和2 型。一般认为2 型的恶性程度显著高于1 型。进展期肾癌的生物学特点之一为静脉系统受到累及,其发生率约4%~10%[3]。静脉系统受累的2 型PRCC 患者预后更差,其5年肿瘤特异性生存率仅为57.4%[4]。但关于肾癌静脉瘤栓形成的机制目前尚未清楚,研究显示,瘤栓的形成与BRCA 的 基 因 突 变[5]、PD-L1表达缺失[6]等有关。miRNA 是一类长约20 个核苷酸的RNA,主要在转录水平上调节基因表达,广泛参与正常及异常的生物学过程,并在肾癌的发生发展中发挥重要的作用[7]。现阶段对于miRNA 在2 型PRCC 下腔静脉瘤栓形成中的作用尚不明确,本研究着重探讨miR-199b-5p 在2 型PRCC 合并下腔静脉瘤栓中的表达及功能。
1 材料和方法
1.1 临床样本及资料
纳入2012年1月~2018年3月在北京大学第三医院及中日友好医院泌尿外科住院治疗的2型PRCC 合并及不合并下腔静脉瘤栓患者组织样本各22 份,44 例患者均经术前CT 和术后病理证实,诊断标准符合2014 版欧洲泌尿外科肾癌诊治指南标准。其中男38 例、女6 例;年龄45~84 岁,中位年龄66 岁。所有研究对象均签署知情同意书,本研究获得北京大学第三医院及中日友好医院伦理委员会批准。
1.2 miRNA 芯片、细胞和主要试剂
miRNA 芯 片 为Agilent Human miRNA,Release 21.0(8×60K,Design ID:070156)。人肾癌细胞系CAKI-2 和CAL-54 细胞分别从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和德国DSMZ 获得。CAKI-2 培育在含10%胚牛血清(FBS)的McCoy's 5A 培养基,CAL-54 在含有15%FBS、0.4μg/ml 氢化可的松和10ng/ml EGF 的DMEM 细胞培养基中生长。细胞培养基和胚牛血清购自Gibco 公司;TRIzol 试 剂 购 自Invitrogen 公 司;RT-qPCR 引 物由北京天一辉远生物公司合成;CCK8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。miR-199b-5p过表达质粒(miR-199b-5p-up)及阴性对照质粒(NC)均为上海吉凯生物公司产品。瞬转试剂使用Lipofectamine 2000(Thermo Fisher,11668030)。逆转录及RT-qPCR 试剂盒为北京全金式生物公司产品。
1.3 主要实验方法
细胞系选择: 基于PRCC 癌细胞性状的文献证据及基因表达特性,选择了CAKI-2 和CAL-54细胞作为2 型PRCC 最适合的细胞系[8]。细胞培养技术遵循常规细胞培养技术方法,瞬转操作按照Lipo2000 说明书操作。
CCK-8 检测细胞增殖能力:取对数生长期的CAKI-2、CAL-54 分别转染miR-199b-5p-up 和NC 后,接种于96 孔板,每孔接种1×103个细胞,每组设置6 个复孔。于转染后24h、48h、72h、96h、120h,分别在每组各孔加入10μl CCK-8 溶液,37℃孵育3h 后于酶标仪450nm 处测量吸光度。
细胞侵袭实验: 使用Matrigel 基质胶与PBS缓冲液按1:8 比例配置Transwell 小室基质膜。消化、离心、计数细胞后,按照2×104/ml 用无血清培养基稀释细胞制备成CAKI-2、CAL-54 细胞悬液。按照每孔200μl,将细胞悬液加入Transwell 上室,下室加入完全培养基500μl,37℃孵箱培养24h 后,使用75%乙醇及1%结晶紫溶液固定和染色,晾干后拍照计数。
RNA 提取、逆转录、qPCR:使用TRIzol 试剂提取组织和细胞中的总RNA,按照试剂盒说明书逆转录为cDNA,qPCR 采用SYBR Green I 荧光染料法完成。miR-199b-5p 正向引物为5’-CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC-3’,反向引物为通用引物;细胞增殖抗原(Ki67)正向引物为5’-AGAAGAAGTGGTGCTTCGGAA-3’,反向引物为5’-CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA-3’;基质金属蛋白酶2 (MMP2) 正向引物为5’-CCCACTGCGGTTTTCTCGAAT -3’,反向引物为 5’ -CAAAGGGGTATCCATCGCCAT-3’。采用GAPDH作为内参,正向引物为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’,反向引物为5’-CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT-3’。通过2-△△Ct 计算RNA 相对表达量。所有实验均独立重复3 次。
1.4 统计学方法
应用SPSS22.0 软件进行统计学分析。2 组数据之间的比较采用独立样本t 检验,多组间数据比较采用单因素方差分析。
2 结果
2.1 miR-199b-5p 在肾癌合并下腔静脉瘤栓癌组织中表达下调
miRNA 芯片检测发现,在2 型PRCC 合并下腔静脉瘤栓癌10 例患者的组织中相对于配对的不合并下腔静脉瘤栓的癌组织中,包括miR-199b-5p、miR-218-5p、miR-96-5p 等63 条在内的miRNA 下调; 包括miR-7155-3p、miR-4685-5p 等的154 条miRNA 上调(图1A,见封二)。使用RT-qPCR 在22 对样本中对差异表达的候选基因进行扩大样本验证,发现miR-199b-5p 在肾癌合并下腔静脉瘤栓中表达显著下调 (P<0.05)(图1B,见封二)。
图1 合并及不合并瘤栓患者癌组织中差异表达miRNA筛选。A.miRNA在合并及不合并下腔静脉瘤栓患者组织中差异表达。B.miR-199b-5p在合并下腔静脉瘤栓癌组织中表达显著下调(P <0.05)。
2.2 过表达miR-199b-5p 抑制肾癌细胞增殖、克隆形成、侵袭能力
为了验证miR-199b-5p 生物学功能,使用CCK-8 法检测过表达miR-199b-5p 对于CAKI-2和CAL-54 细胞增殖影响。与NC 组相比,miR-199b-5p-up 组的CAKI-2 和CAL-54 细胞增殖活力降低,并呈时间依赖性(图2A 和2B,见封二)。细胞侵袭实验结果表明,与NC 组相比,miR-199b-5p-up 组的CAKI-2 和CAL-54 细胞的侵袭能力降低(P<0.05)(图2C 和2D,见封二)。
图2 过表达miR-199b-5p的细胞功能学实验。A、B.过表达miR-199b-5p可以抑制CAKI-2和CAL-54细胞增殖能力。C、D.过表达miR-199b-5p可以抑制CAKI-2和CAL-54细胞侵袭能力。
2.3 2 型PRCC 合并下腔静脉瘤栓组织样本中Ki67 和MMP2 表达显著升高
图3 示,与不合并下腔静脉瘤栓组织相比,合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67 和MMP2 表达显著升高(P<0.05)(图3)。
图3 肾癌合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67 和MMP2 表达
2.4 过表达miR-199b-5p 后Ki67 和MMP2 表达下调
图4 示,过表 达miR-199b-5p 后,Ki67 和MMP2 在CAKI-2 细胞中表达显著下调(P<0.05),而在CAL-54 细胞中无差异。
图4 过表达miR-199b-5p 后瘤栓和MMP2 表达下调
3 讨论
肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一,25%~30%的患者在诊断时已经发生转移性疾病[9]。肾癌Ⅰ期患者的5年生存率为95%[10],而2 型PRCC的患者预后更差。对于合并下腔静脉瘤栓的患者,5年总体生存率及肿瘤特异性生存率分别为41.9%及47.7%[11]。因此,明确肾癌合并瘤栓的发病机制,对于早期发现和治疗肾癌具有重要意义。
3.1 miR-199b-5p 在2 型PRCC 合并瘤栓患者中的表达情况
本研究发现,与不合并下腔静脉瘤栓的2 型PRCC 患者相比,合并瘤栓的患者癌组织中miR-199b-5p 显著下调。通过体外细胞系中将miR-199b-5p 过表达,肾癌细胞的增殖和侵袭能力显著降低。结果提示,miR-199b-5p 与PRCC 瘤栓的形成密切相关。相关文献报道,miR-199b-5p 参与到多种肿瘤的生物学行为:Won 等[12]提出miR-199b-5p 通过介导的Notch 信号通路促进骨肉瘤的发生发展;Fang 等[13]的研究表明miR-199b-5p的下调与乳腺癌侵袭性临床特征相关,且miR-199b-5p 下调是与乳腺癌患者更差的总体生存率相关,是其独立的不良预后因素;Wang 等[14]报道,miR-199b 低表达可能通过介导缺氧诱导因子-1α 上调促进肝细胞癌进展并与生存率呈负相关。在泌尿系统肿瘤中,Lai 等[15]报道miR-199b-5p 是肾透明细胞癌的一种抑癌因子,但其具体作用机制尚未阐明。此外,其异常表达也见于卵巢癌及髓母细胞瘤等其他恶性肿瘤[16,17]。
3.2 miR-199b-5p 的下调可能通过介导Ki67 和MMP2 表达调控下腔静脉瘤栓的形成
对于肾癌瘤栓的形成机制,目前研究尚不充分。Gregor 等[18]通过对37 例原发性肿瘤和瘤栓组织进行全外显子组测序,发现瘤栓组织中的约22%的基因存在功能性突变,认为某些亚类基因的突变可能导致肾癌瘤栓形成。Justin 等[19]多组学生物信息学分析发现,肝细胞核因子1β 与肾透明细胞癌的肿瘤相关瘤栓形成有关,但未探究其具体机制。有研究报道肾癌瘤栓的发生与BRCA的基因突变及PD-L1 表达缺失等有关[5,6]。本研究中,我们检测了2 型PRCC 合并及不合并瘤栓组织中代表细胞增殖能力和侵袭能力的Ki67 和MMP2,发现合并下腔静脉瘤栓组织中Ki67 和MMP2 表达显著升高,而在肾癌细胞系中,过表达miR-199b-5p 后,细胞中瘤栓和MMP2 表达下调,提示2 型PRCC 中miR-199b-5p 下调可能通过介导Ki67 和MMP2 表达调控下腔静脉瘤栓的形成。
本研究存在一些局限性。虽然研究证实表达miR-199b-5p 可以抑制2 型PRCC 细胞系增殖和侵袭能力,但具体的分子机制未予更深层次的探究,且体外培养细胞系尚不能代表肾癌的全部病理特征,同时亦缺少挽救实验进行反向验证。