抑癌基因甲基化检测在宫颈病变筛查中的作用

马 莉，卞美璐★，于 欢，李 茜，张庆霞，阳艳军，贺桂芳，陈庆云，陈 曦，邹志远，刘红刚

（1．中日友好医院 妇产科，北京 100029；2.广东省HPV 工程研究开发中心，广东惠州 516000；3.首都医科大学附属北京同仁医院 病理科，北京 100005）

宫颈癌作为一种感染性恶性肿瘤，是全球女性的第四大常见肿瘤[1]。有研究指出[2]，多达80%的女性在一生中会感染人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV），但仅有一小部分感染者进展为恶性病变，为探讨HPV 感染在宫颈癌发生过程中的作用以及癌变过程中宿主基因甲基化的情况，本研究对我院宫颈病变诊疗中心门诊机会性筛查女性的宫颈脱落细胞学样本中HPV 分型以及甲基化情况进行了分析。

1 资料与方法

1.1 患者一般情况

选取2019年10月～2020年1月在中日友好医院宫颈病变诊疗中心门诊就诊的机会性筛查女性494 例，年龄18～71 岁，平均38.6±10.2 岁；其中18～35 岁人群占比42.5%（210/494）。

入组患者主要为既往HPV 感染史、异常液基细胞学检查（liquid-based cytologic test，LBC）诊断及Leep 术后随访异常者，均进行阴道镜检查及活检。包括：（1）HPV16/18 型阳性者100 例；（2）非16/18 亚型HPV 感染者伴LBC≥非典型鳞状上皮细胞意义不明确 （atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US）228 例； （3）LBC≥非典型鳞状上皮细胞（ASC），不能除外高级别鳞状上皮病变 （atypical squamous cell，cannot exclude high -grade squamous intraepithelial lesion，ASC-H） 者53 例；（4）Leep 术后随诊发现LBC≥ASC-US 者113 例。所有样本同时进行了HPV37 分型检测和甲基化检测。

1.2 实验方法

1.2.1 HPV37 分型检测

用HPV37 分型试剂盒（hybrid bio，中国），采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）+导流杂交技术检测宫颈细胞标本中37 种HPV基因型感染，高危型HPV 包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，共13 种亚型；中危型HPV 包含26、53、66、73 及82，共5 种亚型；低危型HPV 包含6、11、42、43、44、34、40、54、55、57、61、67、69、70、71、72、81、83、84，共19 种亚型。

1.2.2 甲基化检测

1.2.2.1 DNA 分离和亚硫酸氢盐处理

根据制造商的建议，用DNA 迷你试剂盒（hybrid bio，中国）从收集到的宫颈脱落细胞样本中提取基因组DNA。使用NanoDrop One/One c（Thermo scientific，美国）测定DNA 浓度。DNA 产量为＞200ng 的样品被考虑用于进一步的测试。亚硫酸氢盐处理纯化基因组DNA 时，根据制造商的建议使用DNA 甲基化试剂盒（hybrid bio，中国）。

1.2.2.2 DNA 甲基化测试

利用ABI7500 PCR 系统 （Life Technologies，Thermo Fischer Scientific，美国）扩增taqman 为基础的定量甲基化-特异性聚合酶链反应（QMSP），测定SOX1 和PAX1 的甲基化水平。我们设计了Actin Beta 基因（ACTB）作为内参，并对每个标本进行了检测。如果标记ACTB 的Ct 值≤35，则认为样品具有足够的质量。总反应体积25μl 包含2μl modifified 模 板DNA，23μl 定 制TaqMan 试剂。PCR 在以下条件进行：95℃10min，95℃10s共45 个循环，60℃（根据引物集）20s。如果甲基化SOX1 的Ct 值≤38.6，或者甲基化PAX1 的Ct值≤38，则认为整个DNA 甲基化试验为阳性。

1.2.3 组织病理学

组织病理学诊断标准依据世界卫生组织（WHO）（2014）宫颈病变的分级系统[3]，所有样本的组织病理学诊断均由2 名专业病理医生独立诊断分析。

1.2.4 统计学方法

应用SPSS22.0 软件，计数资料采用率或百分比（%）进行统计描述，组间比较采用 字2检验，理论频数1～5 时，进行校正或用Fisher 精确概率法。计算具有95%可信区间（CI）的比值比（OR），来评价不同因素作用下的感染风险。

2 结果

2.1 HPV37 分型结果

对低、中、高危型HPV 共计37 种亚型进行了检测。494例样本中，除了HPV26、HPV57 和HPV83 亚型未检测到，其他34 种HPV 亚型的总感染率为63.36%（313/494）； 其中低危型HPV 总感染率为23.28%；中危型HPV 总感染率8.30%；高危型HPV 总感染率54.05%。因HPV 感染有多重感染状态，感染率以感染频次计算，故低、中、高危型感染计数累计高于总感染计数阳性值。

HPV 感染的状态：HPV 单一感染率55.59%（174/313）；多重感染率是44.41%（139/313）。患者既往有HPV 感染病史者，本次HPV37 分型检测结果与其既往HPV 分型结果相比较，如果有HPV检测结果的改变或者HPV 感染型别的改变，视为HPV 反复阳性，其中包括HPV 转阴性而本次结果再次阳性病例；如果既往和本次HPV 检测结果均为阳性且HPV 型别没有变化，视为HPV 持续阳性。本组患者HPV 反复阳性136 例，占27.5%；HPV 持续阳性247 例，占50.0%。

表1 不同组织病理学诊断的HPV 感染状况 n（%）

表2 甲基化阳性的危险因素统计

表3 HPV37 分型检测和甲基化检测的诊断效能

以组织病理学诊断进行分组，HPV 感染情况见表1。≥高级别鳞状上皮内病变 （high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）HPV 感染率随着病变程度的加重而增加，在SCC 和腺细胞癌（adenocarcinoma，AC）中感染率均为100%，组间比较有统计学差异 （P<0.01）。以组织病理学诊断≥HSIL 为宫颈病变阳性的标准，HPV 感染显著增加宫颈病变的发生风险 （OR=1.949，95%CI：1.321～2.875，P<0.01）。

本组患者HPV16 型感染率最高，占19.03%（94/494）：单一感染52 例、占55.32%（52/94）；多重感染42 例、占44.68%（42/94）。HPV16 型感染是甲基化阳性、HSIL 和SCC 的危险因素 （均P<0.01）。

2.2 甲基化结果

本研究主要对宿主基因组中的SOX-1 和PAX-1 进行了甲基化检测，494 例样本甲基化总阳性率为16.40%（81/494），其中SOX-1 的阳性率为10.12%（50/494），PAX-1 的阳性率为15.18%（75/494），二者均阳性者44 例，占总阳性人数的54.32%（44/81）。

高危型HPV 感染、HPV 单一感染、HPV 持续感染以及具有HPV 感染病史，均为甲基化阳性的危险因素（均P<0.01）。具体见表2。

2.3 HPV37 分型检测和甲基化检测的诊断效能

以组织病理学诊断≥HSIL 为金标准，计算2种方法的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值；同时分析了在≥HSIL 病例中，甲基化检测对HPV 检测阳性的分流作用。表3 示，甲基化检测联合HPV37 分型检测极大提高了对≥HSIL 病变筛查的敏感性和阴性预测值。

3 讨论

尽管存在宫颈癌疫苗、 常规筛查以及针对宫颈癌前病变的规范化治疗等多种预防和干预措施，宫颈癌仍然是全球女性的第四大常见肿瘤[1]。据报道[4]，我国每年约有新发病例10.6 万，占世界宫颈癌新发病例总数约18.6%，伴随生活节奏的加快以及人们对性行为思想的开放，宫颈癌的发病年龄呈现逐渐年轻化趋势。

根据HPV 致病能力的不同，可分为低危型、中危型和高危型；据感染方式不同，又分为单一感染和复合感染（2 种及以上HPV 亚型同时感染）。多年来，随着对宫颈癌病因学研究的深入，宫颈癌作为一种感染性恶性肿瘤，是可防可控的。目前发现的HPV 基因型多达200 多种，世界范围内最常见HPV 基因型是HPV16 型，它也是高危型HPV基因型的最主要类型[5]。

我们研究发现，就诊宫颈病变机会性门诊的患者，以高危型HPV 感染为主，总感染频率为63.36%（313/494）；HPV 单一感染人群中，高危型HPV 感染占82.18%（143/174）。结合组织病理学诊断，我们发现从LSIL 开始，癌变程度重的人群，HPV 感染率增加，在鳞状细胞癌和腺细胞癌中的感染率为100%，HPV 感染增加了≥HSIL 病变的发生风险；SCC 共3 例，均为高危型HPV 单一型感染（100%）。值得注意的是HPV16 作为感染率最高的HPV 亚型，单一感染致病作用较强，是HSIL 和SCC 发生的独立危险因素，本研究SCC 3例，均为HPV16 型单一感染所致，提示HPV16 的致病性不可小觑，这可以很好的解释在美国阴道镜和病理协会 （American Society of Colposcopy and Cervical Pathology，ASCCP） 指南中将HPV16分型阳性与其他高危型HPV 分型区别开来，无论细胞学诊断结果如何都要进行阴道镜下活检的必要性[6]。

有研究表明[2]，多达80%的女性在一生中会感染HPV，但仅有一小部分感染者进展为恶性病变，这提示我们应该还有其他因素参与调节了宫颈感染发展为恶性肿瘤的过程。癌基因和抑癌基因的突变及表观遗传学改变是参与肿瘤发生进展的重要机制。DNA 甲基化是最常见的基因表观遗传学改变[7]，发生于肿瘤抑制基因的启动子区域，造成该基因的转录失活，从而促使肿瘤的发生[8]。

本研究HPV 检测总感染率达到63.36%，最终组织病理学诊断在HSIL 及以上的仅占23.89%（118/494）。因此，我们在DNA 甲基化方面也进行了初步探讨。

本研究中甲基化选取的是PAX-1 和SOX-1 2 个基因的甲基化位点。（1）配对盒基因转录因子家族成员PAX1，定位于染色体20p11，主要参与生骨节的分化，在哺乳动物脊柱和胚胎细胞的增殖控制过程中发挥关键作用[9]。早在2008年，有研究发现[10]，PAX1 基因在宫颈癌中出现甲基化异常，PAX-1 基因在宫颈癌中因启动子趋于甲基化而表达抑制失活，经去甲基化处理后基因可重新表达，PAX1 基因甲基化改变在宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN） III 及浸润性宫颈癌患者的宫颈脱落细胞中被检测到。近年来多项研究发现[11～13]在浸润性癌的鉴别中PAX1基因检测的甲基化指数特异性更佳，而在CINⅢ以上病变的筛查中特异度亦具有明显的优势。（2）SOX1 为性别决定区域Y1，它定位于染色体13q34 上，具有参与胚胎发育的调节以及决定细胞存亡的功能[14，15]。既往有研究表明，SOX-1 基因在肺癌[16]、肝癌[17]、卵巢癌[18]、食管癌[19]等多种恶性肿瘤中甲基化水平增高，2016年的一项Meta 分析表明[20]SOX-1 基因甲基化在宫颈癌检测中具有较高的敏感性，可望成为一个潜在的宫颈癌筛查的分子标志物。

本研究发现HPV 感染是甲基化阳性的危险因素，包括高危型HPV 感染、HPV 单一感染、HPV持续感染以及具有HPV 感染史者； 而HPV16 型感染，是37 个亚型中唯一的独立危险因素，这进一步提醒我们在筛查的过程中，遇到HPV16 阳性者应当给予高度重视，增加患者的随访以及给予积极的临床处理。

本研究比较了HPV 和甲基化2 种检测方法对≥HSIL 病变的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，发现甲基化检测对HPV37 分型检测的分流效果明显，可以大幅度增加筛查≥HSIL 病变的敏感性和阴性预测值，分别达到了97.6%和96.3%； 本研究结果证明甲基化检测阳性结果更具临床意义，可以更好地辅助HPV 检测筛查≥HSIL 病变。但是甲基化检测阴性结果的解释，需要更多临床数据支持，如何对其进行管理，有待于进一步研究。