沙利度胺调控TRPV-1通路兴奋性发挥镇痛作用

田军 宋铁鹰 宋春旺 户月 王虹 张在旺 王文立

沙利度胺(Thalidomide)是一种合成谷氨酸衍生物，为非巴比妥类药物，于1957年由德国的Chemie Gruenenthal制药公司生产，作为一种镇静和止吐剂被引入市场。其针对恶心、呕吐等早孕反应的效果理想。而由于20世纪60年代出现的严重的致胎儿畸形的不良反应，而迅速被禁止使用[1]，退出市场。但最新研究发现，沙利度胺同时具备调节免疫和拮抗血管生成的作用[2]，而且，在恶性黑色素瘤、麻风结节性红斑等则显示出良好疗效，而回归市场[3-5]。同时应用于治疗骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤[6,7]。而且，越来越多的关于沙利度胺作为镇痛剂或镇痛辅助剂的临床应用，被报道和进一步研究[8-10]。瞬时感受器电位(TRP)通道，是位于中枢和外周神经系统的一大类离子通道，分布广泛。它们与感知温度、有毒物质和疼痛有关。研究表明，在免疫应答和痛觉感受中TRP通道起着重要作用[11]。 TRPV1是TRPV家族中目前研究较多的成员之一，是一种人体分布较广泛的非选择性阳离子通道。早期研究发现，TRPV1在外周感觉神经系统分布广泛，近来人们认识到，TRPV1也可能存在于非神经元细胞和组织中，可被多种内源性或外源性介质激活或致敏，尤其可介导疼痛的产生和痛觉增敏[12,13]。在TRPV1被发现后的二十多年中，越来越多的证据支持(TRP)通道和生理性、病理性疼痛有关，而逐渐成为当前疼痛研究领域的热点[14,15]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 野生型小鼠：40只雄性C57小鼠，25～28 g，购自河北医科大学实验动物中心动物合格证编号：1902095，TRPV1基因敲除小鼠：来自中国中南民族大学。所有的老鼠都被饲养于12 h的明暗交替的清洁环境中，并被允许随意获取食物和水。小鼠适应性喂养1周后，对其进行编号，利用随机数字表将小鼠分组；TRPV1基因敲除小鼠分为2组，分别为空白对照组和沙利度胺组；野生型小鼠分为2组，分别是模型组、通路抑制剂(A784168)组：每组20只，每组分为2个亚组，分别为对照组、沙利度胺组，其中每个亚组10只。小鼠正常进食水，实验前12 h，停止进食。这项研究严格按照美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)实验室动物护理和使用指南中的建议进行。本方案经石家庄市第一医院动物实验伦理委员会批准。

1.2 人胚胎肾细胞293(HEK293)细胞培养 TRPV1通路过表达HEK293细胞，购自上海佰利公司(中国)。HEK293细胞于10%牛血清培养基培养：37℃、5%CO2、95%空气，每3天传代1次。研究中，单克隆细胞暂混合在一起培养，然后在实验前一天放入96孔的培养皿中。

1.3 小鼠背根神经节(DRGs)细胞培养 将小鼠背根神经节(DRGs)解剖后，置入低温DMEM溶液中(pH值7.4)。去除其周围结缔组织，切碎DRGs，将其碎片置于振荡水浴中(5 ml DMEM 35℃)孵育30 min，同时加入0.25 mg/ml的胰蛋白酶、1.0 mmol/L的胶原酶和0.1 mmol/L的脱氧核糖核酸酶(Dnase)。消化解离后，加入FBS至10%停止消化，离心5 min(1 000 r/min)。细胞颗粒在DMEM/F-12中再次悬浮，使用过滤器过滤(130 μm)。分离DRG神经元(1.0 ml)种植于24孔板(预涂0.1 mg/ml多聚-L-赖氨酸，2.5×105细胞/孔)，培养温度在37℃。并于下一个24 h，加入对非神经元细胞的生长有抑制作用的阿糖胞苷(5 μg /ml)。在实验前1 d，DRG神经元被进一步培养72 h，然后接种到96孔板中。本研究使用的培养基为DMEM/F-12(1∶1)，添加5%胎牛血清，2%不含抗氧化剂的B-27 (Gibco,USA)和L-谷氨酰胺(0.1 mg/ml)。

1.4 药物制备 沙利度胺(Tocris Bioscience,Missouri,USA)溶于DMSO中，用0.9%Nacl稀释至1.0 mmol/L作为原液。沙利度胺原液在使用前用DMSO稀释至所需浓度。TRPV1通道抑制剂(A784168)：购于：上海一飞生物公司；荧光染料Ca2+的荧光染料fluo-4和fura-2购自美国(Invitrogen公司)，实验流程严格按照试剂生产商提供的方案进行，对照组接受相应体积的DMSO注射。

1.5 醋酸扭体试验 本实验采用“醋酸扭体试验”进行实验动物疼痛感觉监测，严格按照“醋酸扭体实验疼痛模型”[16]。方法为：实验小鼠在醋酸扭体实验前1 h腹腔注射沙利度胺(65 mg/kg)；对照组不注射沙利度胺。然后，以0.2 ml/小鼠的体积注射0.6%的醋酸溶液，计算30 min内小鼠翻滚扭体次数(腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起呈“S”型，为一个完整的扭体次数)。

1.6 热板实验 采用全自动智能温控热板仪，热板温度恒定于(55.0±0.1)℃，将小鼠置于一定温度的热板上，热刺激小鼠足部产生热痛觉反应，以小鼠出现“舔足反应”的时间作用为痛反应指标，即：痛觉阈值，判断药物是否具有镇痛作用。筛选合格小鼠3只，30 s 内有舔后足反应者(对逃避、跳跃者弃之)。并各测定正常痛阈值1次。用药后15、30、60 min各测实验小白鼠痛阈1次。如60 s钟仍无反应，即将小白鼠取出，以免时间太久烫伤四肢，其痛阈值为60 s。

1.7 Ca2+荧光成像技术 培养细胞HEK293使用fluo-4 Ca2+荧光指示剂(AM)(10 μmol/L) (Invitrogen,USA)，在室温孵育30 min，然后用PBS溶液洗3次(每次5 min)，待进一步的实验。辣椒素是TRPV1受体的激动剂。当细胞与辣椒素结合，TRPV1受体被激活，导致阳离子(Ca2+)向内流入。荧光信号与细胞内Ca2+浓度直接相关。在细胞模型中，将TRPV1过表达的HEK293稳定细胞接种于96孔板，次日稳定的HEK293细胞接受fluo-4(Ca2+荧光指示剂)处理，然后用不同浓度(0～300 μmol/L)沙利度胺孵育20 min，在FlexStation 3型机器上(Molecular Devices,USA)每2秒记录1次细胞内的fluo-4荧光信号(相对荧光单位，RFU)。小鼠背根神经节(DRGs)细胞使用fura-2(AM)(10 μmol/L) (Invitrogen,USA)孵育染色，它是一种用于测量细胞内Ca2+浓度的比值计量染料，首先将DRG神经元接受fura-2(Ca2+荧光指示剂)预处理，即在室温孵育细胞30 min，然后用PBS溶液洗3次(每次5 min)。继续采用20或50 μmol/L沙利度胺孵育20 min。细胞灌注顺序为0.5 μmol/L辣椒素溶液为100 s和氯化钾溶液(65 mmol/L)60 s。灌注过程中，利用装载了CCD相机(Hamamatsu,Japan)的Axiovert 2000型荧光显微镜(Carl Zeiss,Germany)，每2秒检测fura-2(AM)荧光信号。Fura-2荧光信号的发射光谱随Ca2+的变化而变化，应用F340/F380的比值来确定细胞内Ca2+的浓度。该比值信号独立于fura-2染料浓度、光照强度和光程长度，允许细胞内Ca2+浓度独立于这些伪影来最终确定比值。使用Simple PCI 6软件(Compix Inc,USA)采集荧光图像并进行分析，荧光强度以F340/F380表示，如该产品的生产商设计的方案所述，该方案与细胞内相对Ca2+浓度直接相关。所有荧光图像在室温下拍摄，2次拍摄间隔时间为2 s。

2 结果

2.1 沙利度胺可降低HEK293细胞内TRPV1通道活性 添加10 μmol/L辣椒素,TRPV1通道被激活，导致Ca2+流入，Ca2+荧光信号显著增加。RFU读数大约是320单位。然而,当细胞被3 μmol/L沙利度胺预处理后,RFU降至约300单位。当用高浓度的沙利度胺预处理时，荧光信号进一步降低。如在300 μmol/L沙利度胺预处理下，RFU读数下降了约60%(即320～150单位)。与同时间点对照组(沙利度胺浓度：w/o,μmol/L组) 比较，差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。实验分别独立重复3次，结论相同。在RFU读数被归一化,并与沙利度胺的浓度相结合后,计算出EC 50为26 μmol/L。见表1，图1、2。

表1 单个细胞内相对荧光单位(RFU)

图1 辣椒素激活的TRPV1通道在沙利度胺孵育后的Ca2+变化

2.2 沙利度胺可降低背根神经节(DRG)神经元内TRPV1通道活性 Fura-2荧光信号结果显示，在KCl溶液处理下，DRG神经元均被激活。在没有沙利度胺孵育的情况下，DRG神经元被0.5 μmol/L辣椒素激活(神经元1、2、3、4、5)。然而,在50 μmol/L沙利度胺预处理后,0.5 μmol/L辣椒素溶液无法激活神经元(神经元6、7、8、9、10)。依次进行的3次独立重复实验，应用了不同批次神经元得出了相同的结论，与对照组(同时间点无沙利度胺干预组)比较差异有统计学意义(P<0.05)。即：在没有沙利度胺预处理的情况下对辣椒素溶液敏感的神经元占(62±11)%。然而,在应用20～50 μmol/L沙利度胺预处理的情况下,只有(41±9)%和(28±9)%神经元对辣椒素溶液敏感。见图3，表2、3。

图2 将RFUs归一化并与孵育前使用的沙利度胺的浓度作图

图3 细胞在没有沙利度胺孵育的情况下，DRG神经元被0.5 μmol/L辣椒素激活(神经元1、2、3、4、5)。然而,在50 μmol/L沙利度胺预处理后,0.5 μmol/L辣椒素溶液无法激活神经元 (神经元6、7、8、9、10)

表2 F340/F380 n=15

表3 氯化钾敏感细胞(KCL-sensitive cells)%

2.3 沙利度胺对野生型小鼠可发挥镇痛作用 我们用TRPV1敲除小鼠模型进行醋酸扭体实验研究其缓解疼痛的作用。在醋酸(0.6%)注射ip前1 h前，腹腔注射沙利度胺(65 mg/kg)，体积0.2 ml/小鼠。然后计算30 min内小鼠扭体的次数。野生型小鼠经沙利度胺预处理后，平均扭体次数由原来的54次减少到28次。另外3组独立实验表明同样的结论，与乙酸组比较差异有统计学意义(P<0.01)。野生型小鼠经沙利度胺预处理后15 min，平均热痛觉阈值由原来的26增加到49 s(15 min)；52 s(30 min)；46 s(60 min)，对照组(野生型WT组)热痛觉阈值几乎无变化，另外3组独立重复实验结论相同，与同时间点对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4、5。

2.4 沙利度胺对TRPV1基因敲除小鼠无明显镇痛作用 在TRPV1敲除小鼠和使用TRPV1通道抑制剂(A784168)的小鼠中，使用或未使用沙利度胺的小鼠相比，使用TRPV1通道抑制剂的小鼠的扭体数差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5 沙利度胺通过调节TRPV1通路发挥镇痛作用 在TRPV1过表达的细胞模型，通过TRPV1通道的阳离子内向流入或全细胞电流通过沙利度胺的预孵育显著减少；与HEK293细胞的结果一致，在原代DRG神经元中也发现了同样的现象。同时，在疼痛动物模型中，行为学结果提示沙利度胺可缓解野生小鼠疼痛，但对TRPV1基因敲除小鼠和TRPV1通道抑制剂小鼠无镇痛作用。同时间点干预组与对照组(野生型WT组) 比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表4、5。

表4 扭体次数 n=10,次,

表5 热板实验

3 讨论

20世纪50年代沙利度胺最先在德国上市，用于治疗妊娠期的恶心、呕吐症状的镇静药和镇痛药，因其疗效显著而迅速在广泛使用于全球[17]。但是几年时间里，导致全球发生了极罕见的上万例海豹肢畸形儿，各国政府纷纷立即禁用沙利度胺。然而，对沙利度胺的其他作用研究仍在逐步进行[9]。近年来，沙利度胺在免疫、抗炎、抗血管生成的药理临床研究，在治疗麻风性结节红斑、重症肝炎、肿痛、风湿病、肿瘤等的研究结果显示，沙利度胺是一个很有应用前景的药物[13]。

TRPV1 基因最初发现于外周初级感觉神经元中，广泛分布于哺乳动物背根神经节、三叉神经节及外周神经末梢的C类神经纤维，对多种理化、温度、机械刺激敏感。近年发现其也在中枢神经系统中表达，在大脑对炎症疼痛转化及调节作用中占重要地位[13,18]。TRPV1对Ca2+具有高通透性，与配体结合后激活，导致钙离子等内流，细胞内钙离子增加，进而引起一系列细胞内生理性或病理性反应，最终在疼痛等病理机制中发挥关键作用[18]。TRPV1激活的主要标志为阳离子通道开放。通道开放后二价阳离子(主要是Ca2+)从细胞外进入胞内，进而引发一系列生物学效应。尤其是参与痛觉信号的传导，在介导炎性痛、内脏痛等多种痛觉方面均起重要作用，是目前研究疼痛机制与研发镇痛药物的一大热点[12,20]。

据统计，全球约有1/5的人口罹患慢性痛，而其中约3/4的患者在病程中伴发过焦虑、抑郁、精神障碍等精神疾患，关于慢性疼痛机制的研究和新型镇痛药物的研发具有重要意义[15,21]。在介导神经病理性疼痛和热痛觉过敏中TRPV1通道的存在和激活起着关键性作用。

本实验结果可见，细胞培养方面，沙利度胺的预处理减弱了激动剂辣椒素对TRPV1受体的激活，且这样的衰减呈剂量依赖性；动物实验方面，在醋酸扭体实验和热板实验中，沙利度胺预处理可以减轻野生型小鼠疼痛程度，这与先前报道的沙利度胺具有镇痛效应的事实是一致的。同时，由于沙利度胺对TRPV1敲除或通道抑制剂小鼠均无镇痛作用。因此可见，TRPV1受体参与了沙利度胺的镇痛作用。沙利度胺的镇痛作用是通过调控TRPV1通路发挥镇痛作用。TRPV1受体的激活被沙利度胺减弱，从而减轻疼痛。

需要补充的是，沙利度胺需要预先孵育至少20 min。当沙利度胺与辣椒素同时使用时，整个细胞电流并没有显著降低，仍可见阳离子的向内流入。可以推断，沙利度胺本身并没有直接破坏TRPV1通道与其激动剂辣椒素之间的相互作用。沙利度胺的治疗减弱了激动剂辣椒素对TRPV1受体的激活，但没有完全阻断其通路的开放。

现有研究表明，沙利度胺最严重的不良反应是胎儿的致畸作用，其他常见的不良反应是剂量依赖性的多发性神经炎，主要表现为手足麻木和感觉异常，其他还有嗜睡、便秘、头晕和疲倦[8]。值得欣慰的是，当前研究通过对沙利度胺进行的结构改造，得到了一系列免疫调节药，克服了原型药物的严重不良反应，自2000年开始进行大规模的临床试验，表明这些化合物治疗癌症的潜力，特别是对于那些很少有药物可以选择的癌症[21]。这些药物的强大的抗癌作用意味着IMiDs将走出沙利度胺的阴影，成为有效的抗肿瘤药物[9]。因此，我们重新研究沙利度胺对TRPV1受体的影响，可能会对沙利度胺治疗这类复发性疼痛和神经性疼痛有更多的帮助[6]。

本研究证明，沙利度胺在不同细胞模型中降低了TRPV1通道的激活；动物模型中，沙利度胺发挥了对野生小鼠的镇痛作用，而对TRPV1基因敲除小鼠和TRPV1受体抑制剂预处理小鼠无镇痛作用。可推断TRPV1受体参与了沙利度胺对小鼠模型的镇痛作用。TRPV1受体的激活被沙利度胺减弱，而减轻疼痛。