细胞衰老在特发性肺间质纤维化中作用的最新进展

辛灵恩 李龙

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种不可逆的持续进行性和破坏性的间质性肺疾病，病因复杂且至今不明，发病机制尚未完全明确，其特征是肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞向肌成纤维细胞分化、胶原沉积和上皮向间质转化，最终将导致不可逆转的渐进性呼吸功能不全[1，2]。目前认为IPF是最常见和最严重的肺纤维化形式，纤维化特征是细胞外基质蛋白过度沉积在受损上皮细胞的基底膜和肺间质组织及肺泡腔内[3，4]。IPF在世界范围均可见发病，男性发病较女性更为常见，吸烟是IPF明确的危险因素，高龄是IPF发病最重要的危险因素之一，其发病率和患病率随着年龄的增长而显著增加，2/3的IPF患者发病时年龄>60岁，确诊时的平均年龄为66岁，在>65岁的人群中，估计患病率可能高达每10万人中400例[1-4]。目前仍缺乏彻底治愈此病的治疗措施，治疗上以控制病情进展、改善患者生活质量为主要目标。虽然迄今为止人们对IPF发病机制的尚未完全了解，但越来越多的观点认为包括细胞衰老在内的衰老加速机制在IPF的发病中起重要作用。本文主要综述近年来与细胞衰老相关的研究进展在IPF发病中的作用，以期在细胞分子层面为IPF今后的治疗提供新的线索。

1 细胞衰老

细胞衰老通常被定义为不可逆的细胞周期停滞，是由促衰老应激源诱导的稳定复制停滞的进化保守状态，损伤蓄积刺激细胞周期素依赖性激酶抑制剂p16 Ink4a和或p53-p21Cip1/Waf1的活性，从而拮抗细胞周期依赖性激酶，激活进入衰老状态的两条途径，即p16Ink4a/pRb和p53/p21途径以阻断细胞周期进展[5]。迄今为止描述的3个原发性细胞衰老程序：复制衰老、应激诱发过早衰老、发育程序性衰老[5-7]。50多年前，Hayflick首先描述了细胞衰老，通过试验他观察到人类胎儿成纤维细胞最终会停止分裂，但仍然具有活力和代谢活性，这种现象被称为“复制衰老”或Hayflick极限，即端粒缩短所触发的细胞衰老，这发生在长时间的细胞分裂之后，最终将导致细胞增殖停滞不前[5，6]。“应激诱发过早衰老”发生在“复制衰老”之前，由大量的应激源诱导，越来越多的衰老诱导剂不断被发现，包括癌基因、活性氧物种和细胞毒性化合物等[6]。发育程序性衰老是在胚胎发育早期检测到的一种最新衰老途径，研究发现，该衰老途径依赖于p21CIP1的表达，这与致癌基因诱导衰老具有相同的特征[7]。衰老细胞的特征包括不可逆性生长停滞、形态增大、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的表达、衰老相关异染色质灶形成和衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)的高表达[8]。

越来越多的证据支持细胞衰老与IPF的发病机制有关[5-10]。有研究通过早期干预自杀基因去除衰老细胞，发现可消除IPF动物模型的纤维化发展，在一定程度上恢复衰老小鼠的肺顺应性、结构和弹性，这表明衰老细胞可能导致纤维化肺疾病[5]。有研究提出，随着年龄的增长衰老细胞不断积累，持续存在的衰老细胞是包括IPF在内的慢性年龄相关疾病发展的主要驱动因素[6，7]。在IPF肺的肺上皮细胞、成纤维细胞和祖细胞中与衰老相关的多条通路被激活[9，10]，通过促进肺上皮细胞的异常分泌模式，增强肌成纤维细胞对凋亡的抵抗力，从而加重IPF的发病。

2 细胞衰老在IPF中的作用

2.1 衰老相关的SASP上调与IPF的关系 衰老细胞在代谢上是活跃的，其重要特征是分泌多种被称为衰老相关分泌表型的促炎介质，包括促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等[11]。SASP表型是DNA损伤、端粒功能障碍、表观基因组或有丝分裂信号、氧化应激和其他一些衰老诱导刺激的结果，其刺激因素呈现多样性[12]。SASP以旁分泌和自分泌的方式进行释放，作用于邻近的细胞和周围组织加速其衰老进程，同时反作用于产生它的细胞并产生强大影响，导致与衰老相关的细胞功能障碍、修复失败、免疫功能受损和慢性低度肺部炎症[13，14]。

与衰老相关的细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVS)是细胞间通讯的重要介质，包括外泌体、微泡和凋亡小体[15]。有研究通过研究发现正常人成纤维细胞在细胞衰老过程中EVS的分泌显著增加，EVS可能作为一种新型的SASP在细胞衰老过程中发挥作用[16]。但笔者发现目前关于EVS的报道并不多见。在IPF中，衰老的肺上皮细胞可分泌大量的白细胞介素(interleukin，IL)包括IL-1β、IL-6和IL-8，诱导肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，从而加重IPF的发病[17]。纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor 1， PAI-1)是另一种特征性SASP蛋白，在部分IPF患者的痰、痰巨噬细胞和肺泡中均可见升高[18]。PAI-1长期以来一直被用作细胞衰老的标志物。有证据表明，PAI-1不仅是细胞衰老的标志物，也是诱导细胞衰老的介质，PAI-1在IPF和博莱霉素诱导的肺纤维化模型中的Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells type 2，AEC2)中表达增加，敲除PAI-1基因的小鼠几乎完全消除了博莱霉素诱导的AEC2衰老和肺纤维化，这提示PAI-1的增加可能是AEC2细胞衰老的基础并在肺纤维化形成中起重要作用[6，18]。已知转化生长因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β1)是一种强烈的促纤维化细胞因子能够诱导AEC2衰老，衰老的AEC2分泌一系列促纤维化和促炎介质，激活肺泡巨噬细胞从而促进肺纤维化，而最新研究发现这一过程也受到PAI-1的调节[19]。SASP在IPF发病机制中发挥重要作用，它不仅是细胞衰老的重要特征，也可作为分子介质间接诱发细胞衰老的级联反应，提高细胞衰老的分子生物学标志的检测水平有助于评估病情进展，为IPF的预防和治疗提供新的契机。

2.2 肺上皮细胞衰老 近年来，越来越多的观点支持IFP是一种上皮驱动性疾病，IPF肺组织中尤其是肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cells，AEC)的衰老相关标记物，包括p16、p21和p53蛋白表达明显增加，AEC的衰老可视为IPF中促纤维化的始动因素[20-23]，但AEC在IPF中衰老的机制并不十分明确。最近发现，IPF的活动性纤维化损伤病灶中也存在上皮细胞加速衰老的现象，衰老的上皮细胞可能通过分泌大量的SASP使异常的上皮-间充质相互转化作用持续存在，这在IPF的发病机制中起重要作用[21，22]。最新研究表明，肺上皮细胞暴露于纯碳纳米颗粒会导致氧化应激和细胞衰老，碳纳米颗粒作为空气污染的主要成分，可在肺上皮细胞中通过接触直接触发这种效应[22]。IPF中衰老的AEC通过增加SASP的表达而促进成纤维细胞的迁移、增殖和活化，静息的成纤维细胞活化后获得肌成纤维细胞表型，促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量释放和沉积，过量的ECM最终将导致肺组织重构[1，10]，但迄今为止AEC的衰老与成纤维细胞活化之间的内在机制尚不完全清楚。此外，有实验证实衰老的人支气管上皮细胞分泌的IL-1足以诱导成纤维细胞分化成肌成纤维细胞，这可能在IPF纤维化发展中起一定作用[23]。

也就是说，肺上皮细胞衰老在IPF的纤维化调节中是一个关键的触发点，衰老的AEC并不直接参与纤维化的形成，而是通过活化成纤维细胞间接发挥作用，因而深入研究AEC衰老的机制对延缓纤维化控制病情进展显得十分重要。

2.3 肺成纤维细胞衰老 有报道称成纤维细胞的衰老可能介导了IPF的发生，然而影响成纤维细胞异常活化的衰老机制尚不完全清楚[24-27]。有关实验指出，衰老的肺成纤维细胞是IPF纤维化过程中促纤维化白三烯分泌的关键来源，早期衰老的成纤维细胞合成白三烯通过旁分泌机制刺激胶原合成和纤维化[24]。IL-18是最近发现的一种促炎细胞因子，在结构和功能上与IL-1家族相关，可诱导肺成纤维细胞衰老，Zhang等[25]首次报道了IL-18结合蛋白中和IL-18可能通过抑制细胞衰老而起到抗纤维化作用。已知衰老细胞能够产生较高水平的活性氧，研究发现NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4 ，NOX4)是一种产生活性氧的酶且与细胞衰老紧密相关，IPF患者肺成纤维细胞中NOX4的表达呈结构性上调，过度表达NOX4可诱导肺成纤维细胞衰老从而导致肺纤维化[26]。有研究发现IPF患者肺成纤维细胞p21、p16、p53及与衰老相关分泌表型细胞因子表达增加，这表明IPF肺成纤维细胞具有衰老表型，线粒体功能障碍可能是成纤维细胞衰老的原因[27]。SASP在IPF纤维化发展进程中起着重要作用，除了衰老的肺上皮以外，已证实衰老的肺成纤维细胞亦可分泌大量的SASP，促进向肌成纤维细胞表型分化参与纤维化形成，与此同时肌成纤维细胞衰老伴随氧化还原失衡，这将导致衰老相关的持续性纤维化[25，27,28]。成纤维细胞作为修复损伤的细胞类型之一，在完成了对IPF肺上皮的损伤修复后迅速被免疫清除，如果清除失败，持续存在的衰老成纤维细胞可通过改变分泌型来驱动疾病发展过程[27，29]。成纤维细胞衰老与IPF发病机制的关系较为复杂，有效抑制IPF中衰老肺成纤维细胞的表型转化有望改善IPF患者肺重构和肺功能，这仍需进一步探索研究。

2.4 线粒体异常 线粒体是细胞内重要的能量供应来源，在维持机体内环境稳态中发挥重要作用，随着研究的深入，人们发现除了为细胞供能以外，线粒体还参与了调控细胞生长和细胞周期、细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，线粒体的稳态和正常功能对于不同组织器官的正常生理状态至关重要。新的证据表明，线粒体功能障碍在包括慢性肺部疾病在内的许多人类疾病的发生和发展中起着重要作用[30]。

线粒体功能障碍是公认的衰老标志，其特征是活性氧的产生增加和生物能量学的改变，相关研究发现，线粒体功能障碍可能与特发性肺纤维化的发病机制有关，IPF中低氧或高碳酸血症导致的线粒体功能障碍，通过介导上皮-间充质转化和肌成纤维细胞的激活造成肺上皮细胞持续损伤[31]。在IPF肺肌成纤维细胞中，PARK2基因的表达水平降低，PARK2基因缺乏引起的丝裂原吞噬不足诱导线粒体活性氧的产生增加，这也提示IPF中存在线粒体功能障碍[32]。IPF患者肺内的AEC2有明显的畸形和功能障碍的线粒体积聚，线粒体稳态失调与PTEN诱导的蛋白激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)低表达、自噬不足、内质网应激标志物上调有关[32，33]。IPF肺泡上皮细胞中可以检测到受损线粒体的形态变化及线粒体活性氧增加，而线粒体活性氧可导致细胞内DNA、脂质和蛋白质的氧化损伤加速细胞衰老[33]。线粒体DNA本身对氧化损伤高度敏感，其损伤和随后的突变可导致线粒体功能障碍，形成恶性循环，伴随着线粒体功能障碍的衰老所诱导的生长停滞被称为“线粒体功能障碍相关性衰老”[34]。线粒体不仅通过能量生成调节细胞功能，还通过衰老相关的细胞表型调节细胞功能。有研究表明，线粒体功能障碍引起衰老的机制包括活性氧水平升高、NAD/NADH比值改变等，促进细胞衰老的其他线粒体改变是线粒体动力学异常、氧化磷酸化缺陷和钙稳态失调[9]。众所周知，端粒随着年龄的增长而缩短，端粒的缩短会增加IPF的风险，而线粒体功能障碍也会导致端粒磨损，有报道称，端粒磨损导致染色体缩短最终会减少线粒体的生物合成，二者互为因果，最终将增加活性氧的产生并激活细胞的衰老途径[35]。

线粒体稳态的维持受多种因素的调节，而线粒体异常造成的细胞内活性氧的增加对衰老机制的形成起着至关重要的作用，因此针对细胞内线粒体的抗氧化剂可能在与IPF相关的细胞衰老过程中起到一定拮抗作用。

2.5 PTEN表达缺失 PTEN是一种抑癌基因，也是一种重要的细胞增殖和细胞周期调节因子，现已证实PTEN可通过负性调控参与特发性肺纤维化衰老相关的分子机制[20]。目前已在IPF患者的肺泡上皮细胞和成纤维细胞中检测到PTEN表达降低和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)高激活状态，虽然IPF中PTEN表达缺失的机制尚未完全明确，但已有研究表明PTEN的缺失可能与Caveolin-1蛋白的调节有关[4，36]。Qiu等[20]在早期的研究中利用敲除PTEN基因的小鼠建立博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，证实PTEN的缺失可通过激活Akt通路加速AEC衰老，但目前为止PTEN/Akt通路在AEC衰老中的确切作用仍不清楚。近两年来，Tian等[37]通过免疫组化和免疫荧光检测到IPF肺泡上皮细胞中PTEN呈低水平表达，发现PTEN的缺失可介导一条新的通路，即激活NF-κB(nuclear factor κB)，通过PTEN/NF-κB通路的负性调控也能促进IPF中AEC的衰老和SASP的分泌，随即触发成纤维细胞胶原沉积导致肺纤维化。PTEN表达缺失与衰老相关的IPF发病机制中有密切联系，通过PTEN介导的多种信号通路共同促进AEC衰老进而参与IPF中细胞外基质的形成与累积，因此针对切断信号通路的治疗可能为IPF提供新的治疗方案。

2.6 自噬不足 自噬是一种帮助维持细胞器和蛋白质合成、降解和循环之间的动态平衡以满足代谢需求的过程，是一种依赖溶酶体的以降解受损细胞器和蛋白质为主的细胞途径，随着年龄的增长而减弱[38]。已证明自噬不足会导致细胞衰老，并且在各种衰老状态的组织中已观察到自噬减少的现象，自噬功能缺陷造成细胞内有害成分大量积累进而参与细胞衰老的调节过程[16]。最近的研究证实，IPF患者暴露于香烟烟雾环境中可导致气道上皮细胞自噬不足，进而诱发细胞衰老和SASP的分泌增加[8]。现在普遍认为p62和泛素化蛋白的表达是自噬不足的特征，Araya等[21]利用免疫组织化学检测显示体外模型中的IPF上皮细胞表达的细胞衰老标志p21增加，纤维母细胞灶覆盖的上皮细胞和成纤维细胞均表达较高水平的p62和泛素化蛋白，由此可见自噬不足与IPF中细胞衰老存在密切关联。另外自噬功能缺陷可通过促进氧化应激、功能障碍的线粒体和脂褐素沉积等进一步加重肺损伤[39]。有研究提出IPF中自噬不足是肺泡上皮细胞加速衰老和肌成纤维细胞分化的潜在机制，IPF中自噬减少联合TGF-β可诱导肺泡上皮细胞程序性衰老，而成纤维细胞则通过衰老上皮细胞分泌的SASP诱导肌成纤维细胞分化[40]。另有研究发现，自噬减少与衰老过程中肺纤维化的易感性有关，TGF-β1很可能是自噬减少的原因，由TGF-β1触发的自噬亦可诱导上皮向间充质转化，但TGF-β1与自噬不足的内在联系尚未研究透彻[39，41]。有学者提出，自噬激活不足可能是细胞周期依赖性激酶抑制剂-1调节IPF患者气道上皮细胞衰老的基础[42]。

由此可见，细胞衰老的自噬调节主要针对IPF中肺泡上皮细胞，成纤维细胞主要受到自噬不足的促纤维化调节，自噬失调可以视为IPF中联系肺泡上皮细胞衰老与肌成纤维细胞分化的桥梁。无论是作为发病机制的调节因子还是作为潜在的治疗靶点，自噬在人类肺部疾病中尤其是IPF中的作用日益增加。

细胞衰老与IPF密切相关，随着对细胞衰老在IPF发病中作用的深入了解，以参与细胞衰老过程的分子生物学水平作为研究切入点可能为包括IPF在内的年龄相关的慢性肺部疾病提供新的治疗方案，也为今后的治愈提供可能，反映衰老生物标志物的检测有望在IPF患者疾病进展过程中准确地评估衰细胞老状态协助进行早期临床干预，延缓患者疾病进展改善预后。