“温升三阴，肃金秘阳法”抗肝癌的网络药理学研究*

邱祥玉，谢星星，宋 娜，虎雅敏，关东龙，吴施国

(云南中医药大学基础医学院，云南 昆明 650500)

“温升三阴，肃金秘阳法”是建立在云南吴氏扶阳学术基础上形成的一种治疗原则和方法。“温升三阴法”用于治疗“阳衰阴盛，三阴脏寒”所致的三阴不升，人体气机圆运动失常[1]。所谓“三阴”是指少阴肾、太阴脾和厥阴肝。三阴阳气的升发是整个人体气机圆运动的运行不息的关键，即名为“温升三阴法”。在人体气机圆运动中，有升才有降，有左升也需有右降，左升者，温升三阴，右降者，肃降三阳也。肝木、脾土，升于左，则胃土、肺金、胆火需降于右，升降循环，周流不息，是以整个气机的圆运动得以正常地运转。吴荣祖教授在此理论原则之下：予以吴萸四逆汤“温升三阴”，同时予以杏仁肃降肺金，厚朴肃降胃土，乌梅敛降胆火，三者共取“肃金”右降之意。同时吴荣祖教授认为肾水寒则龙浮，相火不能潜藏其位，而浮越于上，故在温升三阴的基础上，需引火归元。“黄柏、砂仁、甘草”三味药为封髓丹，予之以取“秘阳”之意。少阴阳衰，火不暖土，脾失健运，水湿不化，取苓桂术甘汤，燥土湿以助阳左升。

原发性肝癌（又称肝细胞癌）是临床中最常见且恶性程度较高的肿瘤之一，2020年我国肝癌发病人数达41万，死亡人数39万，死亡率高达95%，严重威胁我国人民的生命健康，手术、介入、放化疗虽然有一定效果，但作用有限[2-3]。吴荣祖教授在临床上运用“温升三阴，肃金秘阳法”治疗内、外、妇、儿等疑难杂症，取效颇佳。在治疗肝癌上亦有较好的临床疗效。

网络药理学利用网络大数据平台，分析药物、疾病、靶点相互作用的机制，与中医药多靶点、多成分特点相一致，有利于中药及中药复方活性成分研究及机制探索[4-5]。本文基于“温升三阴，肃金秘阳法”的立法理论，取吴萸四逆汤温升三阴，苓桂术甘汤温阳健脾，杏仁、厚朴、乌梅肃降肺胃、胆火以“肃金”，封髓丹“秘阳”。采用网络药理学研究在此大法下4个不同治法、方药治疗肝癌的药效活性成分及可能的分子机制，为丰富此理论及后续实验研究提供一定基础。

1 资料和方法

1.1 活性成分的筛选 通过检索中药系统药理数据库和分析平台 （TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[6]查询温升三阴法对应中药（吴茱萸、附子、干姜、甘草），温阳化饮法对应中药（茯苓、桂枝、白术、甘草），肃金法对应中药（杏仁、厚朴、乌梅），秘阳法对应中药（黄柏、砂仁、甘草）的化学成分，并进一步收集各味中药中口服生物利用度（OB≥30%）和药物相似性（DL≥0.18）的活性成分，以纳入后续研究。

1.2 活性成分靶点预测 利用TCMSP数据库查询上述代表药物活性成分对应的靶点信息，以（Homo Sapiens）为检索条件在蛋白数据库（UniProt）（https：//www.uniprot.org/）[7]进行检索，并将获得的各个靶蛋白对应的靶基因名换成对应的基因Symbol。

1.3 肝癌疾病靶点预测 以英文“hepatocellular carcinoma”为 关 键 词 分 别 在 GeneCards（http：//www.genecards/）[8]，OMIM（http：//omim.org/）[9]疾 病 数据 库检索肝癌靶点基因。

1.4 潜在作用靶点预测 运用R语言对药物成分的预测靶点和疾病靶点进行映射取交集，获得“温升三阴，肃金秘阳”法治疗肝癌的潜在作用靶点。

1.5 构建“中药-化合物-治疗靶点”网络图 运用Cytoscape3.7.2软件对获取的中药有效成分靶点构建“中药-化合物-治疗靶点”网络图。采用Cyto Hubba插件进一步分析该网络的关键成分。根据degree值选取网络中排列15位的关键靶蛋白。

1.6 构建蛋白质相互作用（PPI）网络及关键靶点分析将1.4所得交集基因导进STRING（https：//string-db.org/）[10]数据分析平台进行蛋白质互作网络分析。选择“Multiple proteins”作为分析模式，“Homo sapiens”用于生物种类限制，同时选择置信度为≥0.90进一步筛选并隐藏孤立蛋白后构建PPI网络，并且利用R语言 4.0 软件（https：//www.r-project.org/）对该网络中的关键靶点蛋白进行分析。

1.7 将4个治法下的药物活性成分靶点导入Cytoscape 3.7.2 用Cyto Hubba插件分析每个治法网络中的关键成分，根据degree值选取网络中排列前4的关键活性成分。

1.8 GO富集分析与KEGG富集分析 为了进一步分析“温升三阴，肃金秘阳法”作用肝癌的可能机制，利用 DAVID 数据 库（https：//david.ncifcrf.gov/，Version 6.8）对210个潜在靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，分别研究“温升三阴，肃金秘阳法”的主要生物功能与主要信号通路，并运用Graphpad Prism8.0.1.244x64软件对GO富集中的BP（生物进程）和KEGG富集排名靠前的通路条目绘制成柱状图。

1.9 核心活性成分与核心靶点分子对接 通过PDB蛋白质结构数据库（https：//www.rcsb.org/）下载关键靶点蛋白PDB ID并保存为pdb格式。在TCMSP数据库查找关键的有效成分信息，下载并保存为mol2格式。利用AutoDock Tools软件将关键活性成分与关键靶点完成分子对接，再通过pymol软件对所得结果进行可视化展示。

2 结果

2.1 TCMSP数据库有效成分检索结果 根据OB≥30%，DL≥0.18的标准在TCMSP数据库内检索并筛选得到253个有效成分（已删除重复值）。其中温升三阴法中148个有效成分，温阳健脾法中121个有效成分，肃降肺胃中29个有效成分，秘阳法中139个有效成分。

2.2 肝癌潜在作用靶点 将药物活性成分靶点基因229个，与疾病所得的相关靶点取交集，获得210个交集基因为“温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌的潜在作用靶点（见图1）。

图1 “温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌的靶点筛选图

2.3 靶点PPI网络、关键基因分析

2.3.1 PPI网络分析 将所得210个交集基因输入STRING数据分析平台进行PPI网络分析。去除游离节点后，网络中包含210个靶点，818条相互作用连线。

2.3.2 关键基因分析 为进一步分析网络中重要的核心靶点，利用R语言进行筛选并根据度值将PPI网络中核心靶点绘制条形图（见图2）。在该PPI网络中其中度值较大的有STAT3（度值=31）、JUN（度值=29）、HSP90AA1（度值=25）、AKT1（度值=24）、MAKP1（度值=23）、MAKP3（度值=22），IL6（度值=18）等，它们与其他蛋白相互作用，在该网络中发挥了关键作用。其中STAT3是度值最高的。

图2 “温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌的PPI网络关键靶蛋白

2.4 “中药-化合物-治疗靶点”网络图构建及分析将TCMSP数据库筛选得到253个有效成分及2.2中获得的交集基因上传至Cytoscape3.7.2软件构建“中药-化合物-治疗靶点”网络图（见图3）。

图3 “温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌的“中药-化合物-治疗靶点”图

在中药-化合物-治疗靶点”网络图上采用Cyto Hubba插件进行分析，根据degree值选取网络中排列前15位的关键靶点及关键活性成分（见表1）。

表1 “温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌中根据degree值排列的前15个化合物及靶点信息

2.5 “温升三阴，肃金秘阳法”下4个不同治法的关键活性成分及核心作用靶点

2.5.1 4个不同治法的关键活性成分 将“温升三阴，肃金秘阳法”4个不同治法下的药物活性成分及靶点导入Cytoscape3.7.2，用Cyto Hubba插件分析每个治法网络中的关键成分，根据degree值分别选取各个网络中排名前4位的关键活性成分（见表2-表5）。

表2 “温升三阴”网络中排名前4活性成分

表3 “温阳健脾”网络中排名前4活性成分

表4 “肃金”网络中排名前4的活性成分

表5 “秘阳法”网络中排名前4的活性成分

2.5.2 4个不同治法网络下关键活性成分与靶点的关系 为了进一步分析不同网络中活性成分与靶点的关系，据Cyto Hubba插件中的degree值，取网络中排名前12的核心信息。见图4-图7。

图4 “温升三阴法”网络核心信息图

图5 “温阳健脾”网络核心信息图

图6 “肃金”网络核心信息图

图7 “秘阳法”网络核心信息图

2.6 GO富集分析结果 将210个关键靶点通过DAVID数据库进行GO富集分析，其中RNA聚合酶II启动子转录的正调控、信号转导、氧化还原过程、药物反应、凋亡过程、炎症反应等是BP（生物进程）分析中靠前的条目（见图8）。提示“温升三阴，肃金秘阳法”在治疗肝癌过程中通过参与调控多种生物学过程而发挥作用。

图8 生物进程（BP）富集分析图

2.7 KEGG富集分析结果 通过KEGG通路富集分析，取“温升三阴，肃金秘阳法”显著发挥影响的30条通路（见图9）。结果显示，其治疗肝癌的机制主要涉及癌症信号通路，PI3K/Akt信号通路、Hepatitis B信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路（见图10）等。

图9 KEGG信号通路富集图

图10 “温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌的PI3K/Akt信号通路图

2.8 分子对接 在“温升三阴，肃金秘法”的每个治法网络中，MOL000098槲皮素（quercetin）为4个治法共同的活性成分也是预测靶点最多的。PTGS2为中药调控网络中degree值最大的靶点，同时也是四个治法网络中排名靠前的核心靶点之一。因此，将二者选为分子对接的配体和受体。在PDB上检索到PTGS2蛋白ID为5f19并下载其3D结构。分子对接结果显示槲皮素（quercetin）能稳定地对接到PTGS2蛋白结构5f19中，二者通过氨基酸残基ARG-376，ASN-375相互发生作用。

图11 核心靶点的分子对接

3 讨论

“温升三阴，肃金秘阳法”旨在恢复三阴脏寒所致的气机圆运失常。在此法中，运转的圆运动由“中土为轴，金木水火四象为轮”共同构成。少阴肾为命门之火，其温煦及气化的作用是圆运动的动力，脾居中央是气机升降之枢纽，脾阳旺盛带动圆运动中轴的运行，肝木升发标着圆运动正常启功、运行[1]。四逆汤为补火助阳，回阳救逆之要方。吴荣祖教授认为四逆汤中之附子主要用于升举足少阴肾的阳气，作用十分重要；干姜用以温中散寒，炙甘草用以补土以伏火，二药共用，共同升举足太阴阳气；吴茱萸，性温，入肝经，可通过温散厥阴之寒达到升足厥阴肝阳气的作用。故“温升三阴法”在治疗上即体现在吴萸四逆汤上。彭子益所著的《圆运动之古中医学》中云：“杏仁降肺金，开敛结以降肺火，肺金降则相火便降”；“厚朴降胆理胃[11]”，说明了杏仁、厚朴降肺金、胃土、胆火之用，在此取之以“肃金”之意。《素问·生气通天论》云：“凡阴阳之要，阳密乃固”，只有肾中之水将命门之火潜藏其中才是实质意义上的温阳[12]。故而吴荣祖教授认为“温阳”需与“秘阳”共举，创“秘阳法”。“秘阳法”是针对“肾阳虚衰，相火不密”而创以“温水潜阳，引火归元”的一种治疗方法[13]。此处取“黄柏、砂仁、甘草”三味药。苓桂术甘汤可温健中轴脾阳以化饮，消散三阴脏寒停滞之寒饮[1]。故，药物吴茱萸、附子、干姜、甘草、茯苓、白术、桂枝、杏仁、厚朴、乌梅、黄柏、砂仁共同构建了“温升三阴、肃金秘阳”的大法。

本研究运用网络药理学方法对“温升三阴，肃金秘阳法”下各个不同治法抗肝癌作用进行研究。全网络共筛选出210个潜在治疗靶点，利用STRING数据分析平台得出 PPI靶点互作网络中 STAT3、JUN、HSP90AA1、AKT1是治疗的核心靶点。STAT3作为信号转导及转录激活因子家族成员，在肝癌的炎症微环境中发挥重要作用。STAT3不仅参与肝癌的“炎癌转化”，还可直接调控肝癌细胞内与增殖、侵袭、转移相关的基因表达，甚至与肝癌血管生成和免疫抑制有关[14-15]。STAT3被磷酸化后由细胞质转移至细胞核，通过对 Mcl-1、Bcl-xl、c-myc和 Survivin基因表达的调控，促进细胞周期，抑制细胞凋亡[16]。c-Jun是细胞增殖过程中的一种重要转录因子，可通过拮抗抑癌基因p53的活性，抑制肝癌细胞凋亡[17]。c-Jun在HBV相关肝癌的发生过程中发挥重要作用，有研究表明被敲除c-Jun的HBV小鼠，其肿瘤生长受到了抑制[18]。热休克蛋白90a（HSP90AA1）与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移和血管生成有密切关系[19]。有研究发现[20]HSP90AA1的mRNA随着肝癌TNM分期升高，其表达量随之升高。AKT是本文PPI网络中核心治疗靶点之一，是PI3K/Akt信号通路中重要的下游靶标，被磷酸化激活后的AKT是原发性肝癌预后不良的危险因素[21]。异常激活的AKT可存在于多种癌症中，参与癌细胞的代谢，抑制癌细胞凋亡，促进癌细胞增殖以及血管生成[22]。抑制AKT以及磷酸化AKT的表达水平有助于阻滞细胞周期，促进肝癌细胞的凋亡[23]。

通过网络发现，槲皮素不仅是“温升三阴，肃金秘阳法”治疗肝癌网络中度值最高的也是4个治法下度值最高的活性成分。山柰酚是“温升三阴”、“温阳健脾”以及“肃金”3个治法的共有关键成分。β-谷甾醇是“温阳健脾”、“肃金”以及“秘阳”法的共有关键成分。现代研究证明槲皮素是黄酮类化合物的主要成分，对肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用。将槲皮素作用于人肝癌细胞株Hep3、Huh7、HepG2，其结果显示槲皮素可诱导肝癌细胞凋亡[24-25]。也可以降低自由基等损伤产物水平以发挥保肝作用[26]。有研究采用人肝癌LM3模型和裸鼠肝癌模型来观察槲皮素对肝癌的作用，其结果表明槲皮素可抑制肝癌的发展，机制可能是通过作用于JAK2/STAT3信号通路以调节细胞凋亡、侵袭、迁移和自噬[27]。也有研究表明槲皮素可以抑制被生长因子磷酸化的AKT，从而抑制AKT信号通路诱导的肝癌细胞迁移[28]。“自噬细胞死亡”被认为是持续的自噬激活而导致的细胞死亡。山柰酚可诱导HepG2肝癌细胞非凋亡性死亡，其原因可能是诱导肝癌细胞自噬激活[29]。有实验证明，β－谷甾醇可以上调Bax的表达，下调Bcl-2的表达来促进肝癌细胞HepG2的凋亡[30]。此外，李庆勇[31]等人发现β－谷甾醇和豆甾醇具有抑制肝癌细胞SMMC－7721的增殖和诱导其凋亡的作用。

PTGS2是本文中药调控网络中degree值最大的靶标，在分子对接中亦与槲皮素稳定结合。PTGS2是PTGS诱导型基因中的一种，PTGS2也称环氧合酶2（COX-2）。有研究报道PTGS2在肝癌中高表达[32]，此外谢咏梅[33]等人，用western blot检测肝炎、肝硬化、癌前病变及肝癌手术标本的COX-2蛋白表达含量，其结果表明在肝硬化组织中COX-2呈现峰值，表明COX-2可能诱导肝硬化发生癌变。相关研究证明[34]美洛昔康作为一种选择性环氧合酶2抑制剂，在体外和体内均具有抗肝癌细胞增殖和抗血管生成的作用，其机制可能是通过降低HIF-1α的转录激活和表达从而抑制肝癌细胞血管生成，促进细胞凋亡。

综上所述，“温升三阴，肃金秘阳法”具有多成分、多靶点、多通路治疗肝癌的作用模式，其作用的机制可能是通过槲皮素等多种有效成分作用于PTGS2、STAT3、AKT等蛋白调控信号转导，诱导细胞凋亡，以及调控多种生物学功能和PI3K/Akt、TNF等信号通路发挥抗肝癌作用。从分子水平揭示该治疗大法治疗肝癌的潜在化学成分及潜在作用机制，为下一步深入实验验证提供一定的理论依据。