止抽汤对抽动障碍模型大鼠抽动行为及TNF-α、IL-6、IL-1β的影响*

程 艳，黄 爽，冯艳静，唐 彦△

(1.曲靖市中医医院，云南 曲靖 655000；2.云南中医药大学第一临床医学院，云南 昆明 650500)

抽动障碍（TD）是儿童常见的神经精神疾病，主要表现为一个或多个部位反复、快速、无目的地肌肉抽搐或声带抽搐，可伴有情绪障碍、注意力缺失、强迫运动或思考等行为症状[1]。近年来其发病率呈上升趋势[2]。研究发现脑基底神经节病变和多巴胺系统功能障碍与本病的发生密切相关[3]，但单纯针对神经递质失衡的治疗方案存在一定的局限性[4-5]。近年来国内外报道TD的发病机制与神经免疫网络的失衡有关，研究发现TNF-α及白介素家族类中的IL-6、IL-1β、IL-2、IL-12等与本病可能存在关联[6-7]，以这些细胞因子在血清及脑组织增高为主要特点，提示促炎症因子介导了神经免疫反应。

根据本病的临床症状，TD属于中医“肝风证”范畴，目前多数学者认为本病主要与风、痰有关，以熄风化痰为主要治法[8-9]。

全国老中医学术思想指导老师、云南省名中医刘以敏教授在辨治TD时也以“风痰致病”立论，自拟的经验方止抽汤不仅疗效确切，且与同类治疗TD复方相比，止抽汤主药包含云南本地特有的中药蓝花参、山土瓜、荠菜花，有鲜明的地方特色[10]。前期研究发现止抽汤可通过调节纹状体DA系统单胺类递质改善TD模型大鼠抽动行为[11-12]。本实验以此为基础，进一步观察止抽汤对TD模型大鼠细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影响，以期从不同环节探索其作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 24只Wistar大鼠，雄性，日龄28 d，体质量（120±15）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（湘）2014-0011。大鼠适应性饲养1周进入正式实验。

1.2 药物 止抽汤组成：蓝花参15 g，山土瓜15 g，荠菜 15 g，天麻 10 g，钩藤 10 g，白芍 20 g，乌梅 10 g，全蝎5 g，蜈蚣2条，甘草5 g，购自云南中医药大学第一附属医院中药房，煎剂由医院制剂中心提供，浓缩至生药含量1.2 g/mL，贮存于4℃冰箱备用。盐酸硫必利（江苏天士力帝益药业有限公司，批号H32026011），制剂浓度：1.7 mg/mL。

1.3 主要试剂与引物 主要试剂：IDPN（美国Sigma公司，货号317306），使用前以生理盐水稀释成10%的溶液。TNF-α（货号 E-EL-R0019c）、IL-6（货号 EEL-R0015c）、IL-1β（货号 E-EL-R0012c）酶联免疫试剂盒由Elabscience公司提供。TNF-α抗体（货号ab6671）、IL-6抗体（货号 ab9324）、IL-1β 抗体（货号ab9722）抗体，均由英国Abcam公司提供。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，货号 K1622）；SYBR Green master mix（KAPA，货号KK4601）；Trizol试剂盒（Lifetech，货号 15596026）。

引物：引物合成由广州invitrogen公司完成，应用beacon designer 7.90设计Q-PCR引物。引物序列如下。

TNF-ɑ引物：上游 5'-AACAAGGAGGAGAAGTTC-3'，下游 3'-TTGAGAAGATGATCTGAGT-5'；IL-6引物：上游 5'-GAACAACTTACAAGATAACA-3'，下游 3'-GACTCTAACTTCTCCATTA-5'；IL-1β 引物：上游 5'-AACATAAGCCAACAAGTG-3'，下游3'-ACAGGACAGGTATAGATTC-5'。

1.4 主要仪器 电热恒温鼓风干燥箱（上海森信DGG-9140B）；高速冷冻离心机（美国thermo scientific）；酶标仪（美国 Molecular公司 SPECTCA MAX190）；紫外分光光度计（美国NanoDrop ND-1000）；定量 PCR 仪（美国 ABI StepOne）；高速冷冻离心机（塞洛捷克D3024R）；Vortex混合仪（上海启前XH-D）；酶标仪（美国 Molecular公司 SPECTCA MAX190）。

2 方法

2.1 造模及分组 24只Wistar大鼠随机分为正常组6只、造模组18只。正常组腹腔注射生理盐水，造模组腹腔注射 IDPN（150 mg·kg-1·d-1），连续 1 周，参照Napier等报道[13]的方法对大鼠刻板、运动行为进行评分。用药后，造模组大鼠评分均＞2分，造模成功。再将造模组随机分为模型组、止抽汤组、盐酸硫必利组，每组6只。

2.2 给药 正常组、模型组均予生理盐水灌胃，止抽汤组予止抽汤水煎液灌胃，盐酸硫必利组予稀释后的盐酸硫必利溶液灌胃，均按2 mL/100g，1次/d；分别于药物灌胃第7、14天后进行运动行为及刻板行为评分。

2.3 指标检测

2.3.1 ELISA法检测血清 TNF-α、IL-6、IL-1β的水平大鼠末次给药和行为观察后，腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠。在麻醉状态下，抽取3 mL静脉血并注入离心管。静置15 min后，离心机（2 500 r/min）离心5 min，取上清液放入塑料离心管中。用ELISA试剂盒检测大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β的浓度，实验操作严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

2.3.2 荧光实时定量PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平 用TRIzol试剂提取纹状体中细胞总RNA，通过逆转录合成cDNA，以此cDNA为模板。用普通PCR反应扩增TNF-α、IL-6、IL-1β基因的产物。琼脂糖凝胶电泳鉴定后，从凝胶中纯化回收相应的DNA片段，用紫外分光光度计测定其浓度。以10倍梯度稀释作为荧光定量PCR的标准曲线，建立定量PCR反应体系，对相应基因进行定量PCR反应。反应结束后，用荧光定量分析软件测定电泳带密度，以β-actin为内参照，计算目的基因mRNA相对水平。结果以TNF-α、IL-6、IL-1β条带占βactin条带密度的百分比（%）表示。

2.3.3 Western-blot法检测 TNF-α、IL-6、IL-1β 的蛋白表达水平 组织蛋白样品用蛋白中性裂解缓冲液提取，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，丽春红染色，3%脱脂牛奶在37℃下密封1 h，封闭液弃去。依次加入每种待测蛋白对应的一抗、二抗，用化学荧光试剂盒显影固定颜色，并适当曝光。照片经扫描仪扫描后在软件下分析各条带光密度，结果以各蛋白光密度值占其内参照（β-actin）光密度的百分比（%）表示。

3 结果

3.1 各组大鼠运动行为、刻板行为评分比较 造模后第7天，模型大鼠的运动行为和刻板行为评分均高于正常组（P＜0.01）。给药7 d后，与模型组相比，止抽汤组和盐酸硫必利组的刻板行为评分明显下降（P＜0.01），而运动行为评分无统计学意义（P=0.59，P=0.29），止抽汤组和盐酸硫必利组之间差异无统计学意义（P=0.59，P=1.00）。给药14 d后，与模型组相比，止抽汤组和盐酸硫必利组的运动行为和刻板行为评分显著降低（P＜0.01），而止抽汤组和盐酸硫必利组之间差异无统计学意义（P=0.30，P=0.11）。见表1、表2。

表1 各组大鼠运动行为评分比较（±s，n=6）

表1 各组大鼠运动行为评分比较（±s，n=6）

注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别 造模后 用药7 d后 用药1 4 d后正常组 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0模型组 3.5 0±0.5 5# 3.5 0±0.5 5# 3.6 7±0.5 2#盐酸硫必利组 3.6 7±0.5 2# 3.3 3±0.5 2#△ 2.6 7±0.5 2#△止抽汤组 3.5 0±0.5 5# 3.1 7±0.7 5#△ 2.3 3±0.8 2#△

表2 各组大鼠刻板行为评分比较（±s，n=6）

表2 各组大鼠刻板行为评分比较（±s，n=6）

注：与正常组比较，#P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.01。

组别 造模后 用药7 d后 用药1 4 d后正常组 0.6 7±0.5 2 0.1 7±0.4 1 0.1 7±0.4 1模型组 3.5 0±0.8 4# 3.6 7±0.5 2# 3.3 3±0.5 2#盐酸硫必利组 3.6 7±0.5 2# 2.8 3±0.4 1#△ 2.6 7±0.5 2#△止抽汤组 3.6 7±0.8 2# 2.8 3±0.4 1#△ 2.0 0±1.1 0#△

3.2 血清TNF-α、IL-6、IL-1β的结果比较 模型组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显高于正常组（P＜0.01）。与模型组相比，止抽汤组、盐酸硫必利组明显下降（P＜0.01）。止抽汤组与盐酸硫必利组比较差异无统计学意义（P=0.46、P=0.32、P=0.07）。见表 3。

表3 大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（x± s，n=6）

3.3 纹状体 TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平及蛋白表达比较 各组大鼠纹状体TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平，模型组明显高于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，止抽汤组、盐酸硫必利组明显下降（P＜0.01）。止抽汤组与盐酸硫必利组比较差异无统计学意义（P=0.59、P=0.59、P=0.21）。见表 4。

表4 大鼠纹状体TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平比较（x± s，n=6）

大鼠纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平，模型组明显高于正常组（P＜0.05）。与模型组比较，止抽汤组、盐酸硫必利组明显下降（P＜0.01）；止抽汤组与盐酸硫必利组比较差异无统计学意义（P=0.33、P=0.51、P=0.44）。见表 5。

表5 大鼠纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β的蛋白表达水平比较（x± s，n=6）

4 讨论

Diamond等[14]首次提出IDPN造模可成功诱发出大鼠抽动行为，以后陆续为国内外研究者所采用，成为研究本病最常用的造模方法[15]。本实验中，IDPN也成功诱导出大鼠抽动行为，模型大鼠血清、纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β表达明显增高，提示腹腔注射IDPN构建TD大鼠模型可诱导大鼠免疫功能紊乱，从而介导TD的发病，与同类研究的报道一致[16]。

细胞因子不仅是调节免疫炎症反应的关键分子，在外周免疫系统和大脑之间的双向信号传导中起着至关重要的中介作用[17]。研究发现，大量的TNF-α对神经内分泌免疫有不良影响，并对基底神经节造成损害。若基底神经节受损，会影响多巴胺、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、β-内啡肽等神经递质的释放和传递，产生一系列不自主的运动行为障碍，从而影响TD的发生发展[7]。IL-6由神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞产生，在中枢神经系统中起神经营养因子的作用[18]。它与神经递质有关，能显著增加海马和额叶中的5-羟色胺和多巴胺的活性[19]。IL-1β是一种促炎症细胞因子，参与组织破坏或水肿，可引起DA神经元凋亡和坏死，能激活DA神经元退变受体[20]。本实验结果显示TD模型大鼠存在细胞因子异常，以血清及纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β表达明显增高为特点。

药物干预后，止抽汤组大鼠抽动症状减少，血清及纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显下降。推测止抽汤可通过抑制以上促炎细胞因子的表达，减少炎症介质释放，减轻TD神经炎症和脑神经元损伤，进而影响神经递质多巴胺、5-羟色胺、γ-氨基丁酸等的释放，从而控制抽动症状。国内张梦娇等[20]报道玉屏风散通过降低炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达，减轻大鼠抽动症状，与本实验结果一致。而高汉媛等[21]研究显示TD模型大鼠脑组织IL-6含量变化不明显，提示复方中药对TD的神经免疫功能有调控作用，但可能由于复方组成药物不同，具有多途径、多靶点、整体调节作用特点，因此研究结果也有所不同。

综上，本研究证实TD模型大鼠存在细胞因子的异常，神经炎症是本病的重要致病因素。止抽汤改善TD大鼠抽动行为与降低血清及纹状体TNF-α、IL-6、IL-1β的高表达有关。但止抽汤调节外周和中枢炎症的具体机制如何，通过什么途径影响相关神经递质的释放，仍需进一步研究。