溶剂结晶法提取蕨菜叶芽中的植物甾醇

刘美琴，赵玉梅，庞惠文，乔建芬，张鑫

1. 山西铁道职业技术学院（太原 030013）；2. 山西安泰集团（介休 032000）

蕨菜又名如意菜、猫爪子菜、拳头菜，营养成分丰富，粗蛋白和粗纤维含量较高，素有“山菜之王”的美誉，广泛分布于我国海拔500～1 700 m区间的地区[1-2]。蕨菜富含18种氨基酸，其中10种为人体必需氨基酸[3]。蕨菜的幼嫩叶芽中含有丰富天然甾体类物质，如β-谷固醇、豆甾烯-3, 6-二酮、那坡甾酮A等[4]，兼具食用价值和药用价值。植物类甾醇具有降低人体胆固醇和预防心脑血管疾病的功效[5]，被国际营养学会推荐为人类未来十大功能性营养成分之一，现已被广泛应用于医药、化工、食品等领域，其中尤为重要的是在临床医学中，将植物甾醇代替胆固醇应用于药物脂质体制备[6-7]。植物类甾醇对皮肤有很高的渗透性，能保持皮肤水分，促进新陈代谢，抑制皮肤炎症，可作为W/O乳化剂用于化妆品配方生产。试验以山西产蕨菜为原料，采用溶剂提取-结晶法提取甾醇类物质，并对影响甾醇提取量和品质的因素进行了研究。

1 试验部分

1.1 试验中的材料、试剂和仪器

蕨菜，东港市惠源食品有限公司；乙酸乙酯，河南西伯化工产品有限公司；正己烷，常州市中超化工有限公司；乙醇，济南创世化工有限公司。

SHZ-D实验室抽滤机，济宁程煤工矿设备有限公司；DZF-621013真空干燥箱，江苏安盈环境设备有限公司；LWL卧式高速离心机，张家港市越丰化工机械有限公司；HWFT低温恒温箱，苏州菲唐检测设备有限公司；GC-MS3100型气相质谱联用仪，厦门和颂电子科技有限公司；DSRII动态剪切流变仪，上海劳瑞仪器设备有限公司；DR-A1数显阿贝折光仪，泉州天美化工仪器有限公司；DSC7020差示扫描量热仪，上海热冰电子科技有限公司。

1.2 试验方法[8-9]

摘取新鲜蕨菜的嫩绿叶芽，剪碎并粗研磨后倒入足量的乙酸乙酯溶液中，充分浸提6 h后抽滤除去滤渣得到黄绿色滤液。真空浓缩黄绿色滤液得到初步提取的粗提取液。粗提取液高速离心后立即分离出上清液，加入适量的正己烷促进甾醇结晶，结晶时间6 h。滤去溶剂后烘干结晶产物至恒重，再加入足量热乙醇溶液后进行两次重结晶操作，此时得到的结晶物为纯度较高的植物甾醇混合物。将结晶物加入少量的乙酸乙酯溶剂，冷藏于冰柜中备用。

1.3 试验中的相关测定

GC-MS试验条件：进样量1.0 μL，氮气载气流速2.0 mL/min，色谱柱HP-10MS（10%甲基聚硅氧烷+90%二甲基苯；25 m×0.5 m mid，0.25 μm薄膜），进样口温度220 ℃，柱温起始温度100 ℃，以10 ℃/min速率升温到280 ℃；DSC分析：采用DSC7020差示扫描量热仪测定甾醇的吸热曲线，扫描温度范围20～250℃，升温速率5 ℃/min，氮气流量20 mL/min；表观黏度的测定[10]：采用动态流变仪测定甾醇表观黏度，样品0.1 g，锥板夹具直径50 mm，锥角2°5’±2’，剪切率从0.1 s-1到100 s-1。

甾醇含量的测定[11]：用无水乙醇溶解0.1 g结晶样品并定容至25 mL容量瓶。取出5.0 mL溶液后加入2.0 mL磷硫铁显色剂，混匀后静置30 min，在525 nm波长处测其吸光度来计算甾醇含量，如式（1）所示。

式中：m为样品所测吸光度所对应的甾醇量，μg/mL；V为定容体积，mL；B为稀释倍数；M为样品质量，μg。

2 结果与讨论

2.1 GC-MS分析

提取液的GC-MS分析图谱如图1所示。主要出峰时间集中在18～28 min之间。按照出峰顺序，9个出峰位置依次分别为豆甾烯-3, 6-二酮、1-二十八烷醇、1-二十一烷醇、1-二十二碳烯、β-谷甾醇、豆甾醇、草油甾醇、牛膝甾酮、那坡甾酮A。以检出峰总面积为100%来计，β-谷甾醇含量最大（46.18%），其次为豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%）。可以明显地看出植物甾醇总含量超过85%，说明试验提取方案切实可行，试验效果良好。

图1 提取液的GC-MS分析图谱

2.2 DSC分析

DSC图谱中的玻璃化转变温度与聚合物的基本性能有着紧密的联系。试验提取的甾醇的DSC曲线如图2所示。结果显示甾醇有两个玻璃化转变温度（软段玻璃化转变温度和硬段玻璃化转变温度）。甾醇混合物中分子的软硬段结构发生了一定程度的微相分离。软段玻璃化转变温度为78.86 ℃，硬段玻璃化转变温度为237.15 ℃，在温度低于200 ℃的情况下硬段结构的分子运动范围有限，与软段结构分子之间的接触混合概率较小，从而实现软硬段分子的微相分离，表观上表现为两种玻璃化转变温度相差较大。

图2 甾醇的DSC分析图谱

2.3 不同料液质量比对植物甾醇提取量的影响

不同的原料与乙酸乙酯质量比（料液质量比）对蕨菜中甾醇类物质的提取量柱形图如图3所示。固定其他提取条件不变，料液质量比分别为1：1，1：3，1：5，1：7和1：10，测定甾醇提取量。甾醇类物质的提取量随着乙酸乙酯用量的增大而显著升高，当料液质量比达到1：7时，甾醇提取量达到最大（97 mg/g）；之后增大乙酸乙酯用量，提取效果不甚理想。根据传质规律，若提取溶剂达到一定量时，提取带来的正面效果不及甾醇浓度被溶剂稀释所带来的负面效应，因而料液质量比达到1：10时，甾醇提取量反而略有下降。因此，植物甾醇类物质被提取的料液质量比最佳为1：7。

图3 不同料液质量比条件下对应的甾醇提取量

2.4 结晶过程对甾醇混合物的影响

2.4.1 结晶温度对植物甾醇总含量的影响

考察不同结晶温度（-20，-15，-10，-5，0和5℃）对甾醇混合物含量的影响，从而确定试验中的最佳结晶温度。由图4可知，在低温条件下正己烷易与甾醇混合物共同结晶析出，使甾醇总含量较低。而当结晶温度超过0 ℃时，结晶效果不明显，试验效果不理想。综合来讲，结晶温度应控制在（-10±2）℃范围内为宜。

2.4.2 结晶时间对植物甾醇总含量的影响

考察不同结晶时间（2，4，6，8，10和12 h）对甾醇混合物含量的影响，固定其他试验条件不变，优选试验中的最佳结晶时间。如图5所示，结晶时间越长，甾醇混合物从溶剂中脱离后结晶的可能性越大，纯度越高，考虑到试验效率和结晶时间过长导致甾醇活性下降，结晶时间选择6 h。

图4 结晶温度对甾醇总含量的影响关系曲线

图5 结晶时间对甾醇总含量的影响关系曲线

2.4.3 重结晶对植物甾醇总量的影响

试验考察重结晶次数对于最终植物甾醇提取质量的影响关系，结果如表1所示。随着重结晶次数的增加，甾醇的纯度固然可以随重结晶次数的增大而提升，但同时实验操作的频繁性会使得甾醇提取物的流失量随之增加，使得提取总量下降。植物甾醇纯度达到90%即可满足试验需求，故确定试验重结晶次数为2次。

表1 重结晶次数对植物甾醇总量的影响变化

2.5 植物甾醇混合物在加热过程中的表观黏度和折光系数

表观黏度与甾醇的浓度呈正相关联系，而折光系数在一些情况下也会与表观黏度的变化趋势相同。试验提取的植物类甾醇混合物在加热温度分别为120和180 ℃条件下的表观黏度和折光系数变化值如表2所示。当加热温度为120 ℃时，表观黏度与折光系数均在一个较小的范围内波动，没有很直观的变化趋势，整体而言表观黏度和折光系数随加热时间的延长而小幅增大。但当加热温度为180 ℃时，甾醇分子之间可能发生聚合反应，形成C—C、C—O—C等连接结构的高分子聚合物，同时一些甾酮结构的小分子由于热稳定性较差，会发生结构异变或分解成单元结构更小的分子，整个甾醇混合物的分子结构与原先发生了较大变化，表现在表观黏度和折光系数上，可以明显地观察到二者随着加热时间的延长而显著增大。

表2 植物甾醇混合物的表观黏度和折光系数变化

3 结论

以摘取蕨菜嫩绿叶芽为原料，采用溶剂提取-结晶-重结晶的工艺流程提取其中的甾醇类物质。GC-MS分析结果显示，提取物主要组成成分为β-谷甾醇（46.18%）、豆甾烯-3, 6-二酮（11.86%）、草油甾醇（10.83%）、那坡甾酮A（9.17%）、豆甾醇（8.25%），植物甾醇总含量超过85%。DSC的分析则表现出软硬段分子的微相分离，形成软段玻璃化转变温度（78.86 ℃）和硬段玻璃化转变温度（237.15℃）的两个吸热峰。料液质量比、结晶温度和结晶时间会对提取的植物甾醇总含量产生显著影响，经分析探讨确定，当料液质量比为1：7，结晶温度控制在（-10±2）℃，结晶时间为6 h时试验效果最佳。重结晶次数会对甾醇提取总量产生明显影响，考虑到实验频繁性会减少甾醇提取物的质量，纯度达到90%即可满足需求，确定重结晶次数为2次。试验还研究了在加热过程中甾醇提取物的表观黏度和折光系数所产生的变化，当加热温度为120 ℃时，2种性能参数在一个较小范围内波动；当加热温度为180℃时，甾醇提取物的分子结构发生较大变化，表现在表观黏度和折光系数上，二者随着加热时间的延长而明显增大。综上所述，提取蕨菜中甾醇的试验方法切实可行，提取物的纯度和质量均能达到使用需求，提取物的热稳定性良好，试验效果较为理想。