基于响应面法的杂粮粉酶解工艺优化

马丽媛，李杨*，尚尔坤，张雅娜，郭丽

1. 绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）；2. 绥化市食品药品检验检测所（绥化 152000）

人们习惯上把除水稻、小麦、玉米、大豆和薯类五大作物以外的粮豆作物称为杂粮。杂粮粉是将杂粮经过精细研磨成粉末，可直接或做成多种面类食品供人食用的一种食品。利用科学的配方和精细的加工制成的杂粮粉，不仅营养成分丰富，而且口感更有层次，吸收更快，补充能量更迅速，更抗饥饿[1]。

在我国，生产杂粮粉的加工技术还是较为传统单一的滚筒干燥技术和挤压膨化技术[2]。传统工艺设备简单、易操作，但杂粮粉冲调不均、易结块、黏度大、不易吞咽。婴幼儿肠道内缺少淀粉水解酶，食用杂粮粉后常有胀气、腹泻等问题。袁海娜等[3]在研究婴幼儿谷基配方米粉时，将粳米制成米粉，加入α-淀粉酶，经水解后的米粉黏度降低，更易冲调且不易结块，使婴幼儿更易吞咽、消化和吸收。公丽艳等[4]以6种杂粮为原料制成的杂粮粉，不仅口感有了整体的提升，还提高了杂粮粉的糊化度及复水性。淀粉在酶的作用下水解成小分子，使淀粉的吸收速率加快[5]。Fronetla等[6]将萌芽稻米做成米粉，检测后发现稻米中的可溶性糖、维生素、可溶性蛋白质的含量较未萌发的稻米中的含量高出很多，这是由于萌发过程中酶的催化作用引起的。

开发杂粮粉具有重要的食用价值和可观的经济价值。目前，市面上的杂粮粉多以大米为主料，此次试验以小米、玉米、薏米、绿豆、燕麦为原料，利用复合酶进行水解制作杂粮粉，无论是从营养、口感还是冲调等方面，都将优于传统工艺生产的杂粮粉，为杂粮粉的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设备

1.1.1 材料与试剂

小米、玉米、薏米、绿豆、燕麦（市售，挑选粒大饱满，籽粒圆润、无虫害、无霉变的优质谷物杂粮）。α-中温淀粉酶（酶活力≥2 000 U/g，无锡市雪梅酶制剂科技有限公司）；纤维素酶（酶活力10万 U/g，和氏璧生物技术有限公司）；淀粉葡萄糖苷酶（酶活力≥10万 U/g，北京华迈科生物技术有限责任公司）；中性蛋白酶（酶活力≥6万 U/g，北京奥博星生物技术有限责任公司）；碘化钾、乙酸锌、亚硝酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）；氢氧化钠、硫酸铜、葡萄糖（天津市滨海科迪化学试剂有限公司）；亚铁氰化钾（天津市瑞金特化学试剂有限公司）；冰乙酸（天津市光复科技发展有限公司）。

1.1.2 仪器与设备

CF-100KS型万能粉碎机（广州晨雕机械设备有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市莱华仪器制造有限公司）；XS 365M型天平（瑞士普里赛斯仪器有限公司）；101-3AB型电热恒温鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；JYC-21ES55C型电磁炉（杭州九阳生活电器有限公司）。

1.2 工艺流程

杂粮除杂→粉碎→过孔径0.200 mm筛网→混合→杂粮粉溶液→灭酶→调温→加酶酶解→灭酶→冷却→过滤→测DE值

↘滤渣烘干→称其质量

1.3 操作要点

1) 杂粮除杂：将小米、玉米、薏米、绿豆、燕麦中的杂质（石子、杂草等）剔除，防止杂质污染产品或对试验结果造成误差。

2) 粉碎：将除杂后的杂粮用万能粉碎机粉碎成粉。为避免过热，出现焦粉现象，应采用间歇粉碎法，即一次性磨粉30 s，间歇1 min。

3) 过筛：将所磨杂粮粉末过孔径0.200 mm筛，备用。

4) 混合：按1：1：1：1：1质量比取上述5种杂粮粉，按底物浓度5%加水调浆，不断搅拌，使杂粮粉与水混合均匀。

5) 灭酶：于90 ℃灭酶10 min（使杂粮本身的酶失活）。

6) 调温：将加热后的杂粮浆液冷却至酶解适宜的温度，备用。

7) 加酶酶解：将试验所需的酶按要求加入到预热的杂粮溶液中，酶解一定时间。

8) 灭酶：酶解结束后温度升至90 ℃灭酶10 min（使加入的酶失活），取出冷却至室温。

9) 过滤：将冷却的杂粮粉浆液用八层纱布过滤，滤液用来测DE值。

10) 烘干：将过滤后的滤渣烘干，称其质量。

1.4 DE值的测定方法

用DE值（还原糖含量，Dextrose Equivalent）来表示淀粉的糖化程度，酶解后的浆液还原糖含量越高，则它的DE值越高，表示淀粉水解得越彻底。试验中还原糖含量测定参照GB/T 5009.7—2016[7]直接滴定法进行测定。

2 结果与分析

2.1 最适酶的确定

由图1可知，α-中温淀粉酶和中性蛋白酶的DE值最高，分别为21.9%和17.0%，中性蛋白酶水解植物性蛋白质的效果较其他的蛋白酶更明显，水解谷物类的蛋白会生成分子质量很小但活性很高的短肽分子[8]。黄佩佩[9]的研究指出，在杂粮谷物中淀粉和蛋白质的含量最高，其中淀粉含量在70%左右，蛋白质含量在8%～18%左右，所以中性蛋白酶和α-中温淀粉酶在酶解过程中发挥的作用最大。参考王富盛等[10]多酶复合对玉米粉质构特性的影响，选择效果最佳的两种酶进行1：1复配，这样可增加酶催化位点，可使反应更加快速高效。

图1 不同种类的酶对杂粮粉酶解效果的影响

2.2 α-中温淀粉酶与中性蛋白酶复配比的确定

由图2可知，将α-中温淀粉酶和中性蛋白酶进行不同质量比复配后，DE值表现出先上升后下降的趋势。质量比在3：7～6：4之间，随着α-中温淀粉酶的增加，DE值呈现缓慢上升趋势；在6：4条件下DE值达到最大，为21.9%；随着α-中温淀粉酶持续增加，DE值呈下降趋势。由于α-中温淀粉酶含量过高，会抑制中性蛋白酶的活性，影响酶解效率，从而导致DE值呈下降趋势。此结果与陆东和等[11]在婴幼儿米粉复合酶解技术研究中所研究的α-中温淀粉酶与中性淀粉酶质量比6：4的情况基本相似。

图2 酶复配质量比对杂粮粉酶解的影响

2.3 酶解时间的确定

酶解时间也是杂粮粉酶解的一个重要参数。由图3可知，当酶解时间在30～120 min之间时，DE值呈上升趋势；当酶解时间在120～150 min之间时，DE值呈现下降趋势，且DE值下降趋势明显。当酶解时间为120 min时，杂粮粉的DE值最高，为23.6%。DE值之所以出现这样变化的原因是随着时间的增加，酶解反应不断进行，底物由于被酶解，底物含量由多变少，酶解效果随之变弱，导致DE值变低[12]。陆东和等[11]在婴幼儿米粉复合酶解技术研究中发现，酶解反应随着时间的推移，达到了最佳酶解效果后逐渐变得缓慢，这与此次试验的杂粮粉最佳酶解时间一致。

图3 时间对杂粮粉酶解效果的影响

2.4 酶添加量的确定

酶添加量对杂粮粉的酶解程度影响显著。由图4可知，当酶添加量在0.05%～0.10%之间时，DE值呈显著上升趋势；继续增加酶添加量，DE值呈现下降趋势；当酶添加量为0.10%时，杂粮粉的DE值最高，为22.7%。在一定范围内，酶添加量越高，DE值越高，这是因为酶添加量相对于底物不充足时，随着酶添加量的增加，反应速率随之增加，所以DE值呈现上升趋势；当酶添加量持续增加，而底物浓度相对不足时，反应速率会减慢，DE值的上升速率也会变慢甚至出现下降趋势。张春晓[13]在小米粉制备技术研究中结果显示，酶添加量在一定范围内增加时，DE值逐渐增高，当酶添加量达到某一值时，DE值达到最高后出现下降趋势，这与此次试验的结果基本一致。

图4 不同酶添加量对杂粮粉酶解的影响

2.5 酶解温度的确定

温度对杂粮粉酶解的影响较大。由图5可知，当温度在45～50 ℃之间时，DE值呈现上升趋势；当温度在50～65 ℃之间时，DE值呈现下降趋势；当温度为50 ℃时，DE值最大，为22.7%。这是因为当温度较低时，酶活力较低，反应不充分，所以DE值较低，随着温度的升高，反应物能量增加，单位时间内有效碰撞次数增加，反应速率加快，所以DE值升高；另外，由于酶的本质是蛋白质，随着温度的升高，在超过酶的最适温度后，酶蛋白会逐渐变性失活，从而导致酶促反应速度下降[12]。王富盛等[10]在多酶复合对玉米粉质构特性的影响中指出，中性蛋白酶的最适温度为50 ℃，金静等[14]在酶处理对小米粉黏度的影响中研究发现，α-中温淀粉酶最适温度为50 ℃，与此次试验的结果一致。

图5 温度对杂粮粉酶解的影响

2.6 响应面优化试验

在单因素试验基础上，选取酶解温度、酶解时间、酶添加量3个因素开展Box-Behnken中心组合设计试验，因子编码值及试验结果见表1。

表1 响应面设计及结果

运用Design Expert软件对表1中17个响应值进行回归拟合，得到二次多项回归模型方程：Y=25.36-0.11A-0.087B-0.17C+0.27AB-0.45AC+0.100BC-1.17A2-0.22B2-1.34C2。同时对上述回归模型进行方差分析，结果如表2所示。

表2结果显示：模型极显著，矫正系数R2=0.993 0，说明99.3%的响应值变化能通过该模型解释；同时失拟项不显著，说明可用建立的模型对杂粮粉的DE值进行分析和预测。另外，一次项B、二次项BC对杂粮粉DE值影响显著，一次项A、C，二次项AC、AB对杂粮粉DE值影响极显著。各因素间的交互作用响应曲面图见图6。

表2 响应面二次模型及回归系数的方差分析结果

图6 还原糖含量（DE值）的响应曲面图

通过图6可看出各单因素之间交互作用对响应值的影响程度，响应面越陡，表明该因素对响应值影响越显著[15]。结合方程各项的系数项进行分析，试验中各因素及各因素间交互作用对杂粮粉酶解效果的影响程度依次为AC（酶解温度和酶添加量）＞AB（酶解温度和酶解时间）＞C（酶添加量）＞A（酶解温度）＞BC（酶解时间和酶添加量）＞B（酶解时间）。

2.7 验证试验

经回归方程计算，杂粮粉酶解的最佳工艺参数为酶解温度49.67 ℃、酶解时间为112.29 min、酶添加量0.10%。考虑到实际操作可行性，将工艺参数调整为酶解温度50 ℃、酶解时间为112 min、酶添加量0.10%。在此工艺参数下进行3次平行验证试验，杂粮粉酶解后的DE值分别为25.1%，24.9%和25.3%，其平均值为25.1%，与模型预测25.4%基本相符。

3 结论

采用Box-Behnken响应面法对杂粮粉酶解工艺条件进行优化，软件优化后的DE值为25.4%，而实测值为25.1%，与预测值相差不大，该模型极显著（p＜0.000 1），矫正系数较高（R2=0.993 0），证明模型的可靠性及试验误差较小。响应面法优化的杂粮粉最佳酶解条件为酶解温度50 ℃、酶解时间112 min、酶添加量0.10%，在α-中温淀粉酶与中性蛋白酶质量比为6：4时，杂粮粉的DE值达到最高值，为25.1%。杂粮营养丰富，加工成各种食品成本较低，且受众面广，拥有广阔市场需求和发展前景。研究更易消化吸收、营养成分更全、配方更科学的杂粮粉产品具有重要意义，能够促进杂粮粉产业迅速发展。