不同浓度臭氧对大鼠肠道组织形态及大便球杆比影响研究

吴维圣，张照庆，吴曦

（1.湖北中医药大学针灸骨伤学院，湖北 武汉 430000 ；2.湖北省十堰市人民医院中西医结合科，湖北 十堰 442000；3.武汉市第三医院疼痛科，湖北 武汉 430000 ）

0 引言

臭氧在医学领域应用的深度和广度日益增加，臭氧灌肠在炎症性肠病上可发挥积极作用[1]，但其机制及安全性均不明确。因臭氧的强氧化性，其灌肠后是否对肠道组织及大便性状、球杆比等产生负面影响目前尚无深入研究。本研究采用不同浓度臭氧对正常大鼠进行灌肠，观察臭氧灌肠对大鼠肠道组织及及大便性状、球杆比的影响。

1 材料与方法

1.1 6月龄SPF级雄性大鼠（体重394.8±18.7g）40只（购自湖北省疾病控制中心动物中心），分笼饲养，水、饲料、光照、湿度均符合SPF实验室标准条件，适应性饲养5天后，按随机分段数字表法分为A、B、C、D组，每组各10支（其中B组大鼠实验中死亡一只，原因不明）。A、B、C组分别每日接受20ug/mL、40ug/mL、56ug/mL常压下臭氧与空气混合气体3mL（德国赫尔曼臭氧发生器）灌肠，连续15天；D组：每日接受常压下空气3mL灌肠。

1.2 所有动物于第16日收集粪便：实验者一人固定大鼠，另一人轻柔的对大鼠腹部进行按摩，约3分钟左右，大鼠自行排便，直接将粪便收集于无菌便盒内，1小时内送检，每日收集1次，连续3日。

1.3 所有动物于第19日采用水合氯醛过度麻醉处死，处死后立即打开腹腔，并于距离肛门3cm处截取肠道5cm，立即预冷PBS冲洗，并置于10%中性甲醛溶液中固定。1.1-1.3操作均于每日上午9时开始执行，操作者均具备动物实验资格。

1.4 观察大便的颜色、外观、性状；稀释粪便直接涂片法涂片；革兰氏染色；油镜（10×100）下观察并记录视野内细菌总数、革兰氏阴性杆菌/球菌数、革兰氏阳性杆菌/球菌数；计算每500细菌中革兰氏球菌/杆菌数量及球杆菌比值。

1.5 肠道组织甲醛固定48小时后，依次酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（6μm）、脱蜡HE染色、再次脱水透明，后封片，光镜下观察（4×10、10×10）肠道黏膜、肠腺细胞、杯状细胞、炎性细胞及平滑肌细胞形态、数量变化。

1.6 计量资料采用均数±标准差表示，组间采用单因素方差分析，组内采用t检验，计数资料采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠大便外观形状

黄色条形软便，C组大鼠粪便少许脂肪球，其余各组光镜下无明显异常。

2.2 大鼠大便球菌杆菌比值

见表1 、图1。

大鼠肠道HE染色：各组在4×10、10×10视野下肠道黏膜完整、肠腺细胞未见明显增生或化生、杯状细胞无明显增加或减少、炎性细胞无明显浸润、平滑肌细胞形态亦无明显改变（C组1例出现少许炎性细胞浸润）（见表2）。

表1 各组大鼠粪便总细菌数、球菌、杆菌数量及球杆比

图1 各组大鼠粪便总细菌数、球菌、杆菌数量及球杆比柱状图

图2 A组肠道HE染色（4×10）

图3 A组肠道HE染色（10×10）

图4 B组肠道HE染色（4×10）

图5 B组肠道HE染色（10×10）

图6 C组肠道HE染色（4×10）

图7 C组肠道HE染色（10×10）

图8 D组肠道HE染色（4×10）

图9 D组肠道HE染色（10×10）

表2 各组HE染色形态学改变

3 讨论

人们对臭氧的关注起初始于大气污染及温室效应[2,3]。随着上世纪80年代末期，其逐渐应用于临床，尤其是其在颈、腰椎间盘突出症中应用的杰出表现[4]，人们逐渐开始在各个领域对医用臭氧开展广泛研究，如除菌[5]、神经修复再生[6,7]、肾脏机械损伤[8]、肠道缺血再灌注损伤[9]、恶性肿瘤[10]等领域。因臭氧的强氧化性，其本质上有较强毒性[11]，故其在临床应用安全性值得高度注意[12]，但目前其安全性实验开展较少，其临床循证证据亦不充分。

本实验基于医用臭氧灌肠在肠道疾病中的有效性，开展其安全性实验，观察臭氧灌肠对肠道组织的影响，并判断其对粪便球杆比影响。实验结果证实15天的臭氧灌肠对大鼠的肠道组织并无明显影响，未发现因强氧化导致的各层组织水肿、炎症、坏死，甚至肠道绒毛在普通光镜下亦未发现明显损害表现，考虑可能与肠上皮排列紧密及肠道表面分泌物保护有关。细菌总数有统计学差异，可能与臭氧的抗菌作用有关。但大便球杆比亦未发生明显改变，大便球杆比与肠道内菌群构成、肠道免疫功能密切相关[13]，大便球杆比无显著差异，可在初步认为臭氧灌肠对肠道内微生物群影响不大。

臭氧灌肠后分解生成活性氧，随即会发生一系列氧化应激级联反应并引起多个信号轴“交谈”（crosstalk），这些信号分子如SOD、Nrf2/ARE、IP3/PKB等本实验尚未涉及，将在后续试验中进一步深入研究。