氨基酸对烘烤牛肉饼中杂环胺的抑制作用

薛超轶，梁玉燊，吴家丽，凌 菁，沙 琪，廖红梅，何志勇，秦 昉，陈 洁，曾茂茂

（江南大学食品科学与技术国家重点实验室 江苏无锡214122）

杂环胺是富含蛋白质的食品原料（如肉类等）在热加工过程中产生的一类有害物质。大量研究表明，该类物质通过与DNA 共价结合产生致癌、致突变毒性[1-2]。国际癌症研究机构（IARC）1993年经将喹啉类，包括2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4，5-f]喹啉（IQ）归为2A 级致癌物，2-氨基-3，4-二甲 基 咪 唑 并[4，5-f]喹 啉（MeIQ）、8-MeIQx、2-氨基-1-甲基-6 苯基咪唑并[4，5-b]吡啶（PhIP）、2-氨基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（AαC）和2-氨基-3甲基-9H-吡啶并[2，3-b]吲哚（MeAαC）等归为2B级致癌物[3]。流行病学研究表明，杂环胺的摄入会增加罹患食道癌、胃癌和胰腺癌等的风险[4-6]，因此杂环胺的生成途径和减控受到越来越多的关注。

目前有研究表明，在食品体系中添加一些抑制剂可以抑制杂环胺的产生，如添加人工合成的抗氧化剂[7]，草药和茶叶提取物等天然提取物[8-10]以及香辛料[11-12]等。然而，合成抗氧化剂的安全性，以及在不同区域生长的草药/香料的成分不同和高纯度的天然抗氧化剂提取成本过高，都会限制其在食品工业中的使用[13]。

氨基酸已广泛用于食品中以增加其营养价值，或通过与其它食品成分的美拉德反应来增强食品的风味[14]。此外，有报道称美拉德反应产物（MRP）有许多健康益处，例如已发现葡萄糖和组氨酸的MRP 具有自由基清除活性，并且已鉴定出葡萄糖-组氨酸MRP 中具有强抗氧化物质[15]。有报道称，一些氨基酸可以抑制杂环胺形成，如色氨酸、赖氨酸和脯氨酸可以显着抑制模拟体系中PhIP 的形成，并通过添加氨基酸减少苯乙醛（美拉德反应中PhIP 不可缺少的中间体）的生成[13]，这表明它们可能通过清除苯乙醛抑制PhIP 形成。另一项研究表明，在模拟体系中，200℃加热5 min，可形成PhIP-甘氨酸加合物，这很可能是甘氨酸的羧基和PhIP 的氨基进行脱水缩合；这项研究还发现，加热PhIP 可以诱导其与其它各种氨基酸结合，表明氨基酸可通过形成加合物的形式抑制PhIP 的形成[16]。

本试验使用4 种非杂环胺前体及在模拟体系中具有最强PhIP 抑制能力的氨基酸[13]——组氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸作为杂环胺抑制剂，添至待烘烤牛肉饼中，探究氨基酸对烘烤牛肉饼中杂环胺产生及其理化性质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

17 种杂环胺标准品，包括PhIP、DMIP、去甲哈尔满（Norharman）、哈尔满（Harman）、MeIQx、IQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4，7，8-TriMeIQx、MeIQ、IQ、IQ[4，5-b]Phe-P-1、1，5，6-TMIP、MeAαC、AαC、Glu-P-1，美国Santa Cruz 公司，所有标准品的纯度均高于99%；硅藻土、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸，百灵威公司（中国北京），所有标准品的纯度均高于99%；Oasis MCX（3 cc/60 mg）固相萃取柱，美国Waters 公司；UPLC-MS 级乙腈、甲醇和甲酸，美国Thermo-Fisher公司；乙酸乙酯、甲醇、氨水、氢氧化钠为分析级，中国上海国药化学试剂有限公司；牛里脊肉，购于无锡欧尚超市。

超高效液相色谱串联四极杆质谱，使用Acquity UPLC BEH C18 柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美国Waters 公司；Visiprep 型固相萃取仪，美国Sigma 公司；氮吹仪，上海泉岛公司；电子天平，瑞士Mettler Toledo 公司；IKAT－18 型均质机，德国IKA 公司；烤箱Rational SCC 61E Selfcooking Center，德国National 公司；Sigma 3K15型冷冻离心机，美国Sigma 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 烘烤牛肉饼的制作

1）空白组的制作 取绞碎牛里脊肉（40 ±0.1）g 置于直径6 cm 培养皿上，制成约1 cm 厚的牛肉饼，225℃烤制20 min（10 min/面）。烤好的肉饼冷却后冻干，粉碎机粉碎，于-20℃冰箱贮存备用。每个样品做3 个平行。

2）试验组的制作 在空白组基础上，分别添加质量分数0.01%，0.05%和0.10%的组氨酸、亮氨酸、脯氨酸和甲硫氨酸于鲜肉中，其余制作与烤制方法同空白组，每个样品做3 个平行。

1.2.2 烘烤牛肉饼基本组分的测定 样品中水分、蛋白质、脂肪和矿物质，pH 值测定分别参照国家标准GB5009.3-2016《食品中水分的测定》[17]、GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》[18]、GB 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》[19]、GB 5009.4-2016《食品中灰分的测定》[20]和GB 5009.237-2016《食品pH 值的测定》[21]。

1.2.3 烘烤牛肉饼质构的测定 将肉饼切成1 cm3的正方体，做双循环压缩试验，测定其硬度、凝聚性、咀嚼性和弹性。质构测定试验条件：预测试速度1.0 mm/s，测试速度2.0 mm/s，测试后速度2.0 mm/s，应变力75%，触发类型为自动型，触发力5.0 g。

1.2.4 烘烤牛肉饼中游离态和结合态杂环胺的测定 游离态杂环胺的提取参考Chen 等[22]的方法。称取4 g 牛肉饼粉末，加入30 mL 1 mol/L 氢氧化钠溶液，均质1 min，将肉糜转移至盛有14 g 硅藻土的三角瓶中，加入50 mL 乙酸乙酯，混匀后超声萃取2 次，每次30 min，所得上清液即游离态杂环胺提取液，用于固相萃取。固相萃取操作参考文献[22]。

色谱条件：UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温45℃；流动相A 为100%乙腈，流动相B 为3 mmol/L 乙酸铵（pH 4.75）；洗脱梯度：0～0.1 min 为4% A，0.1～18 min为40% A，18～20 min 为70% A；20～22 min 为100% A；22～22.1 min 为4% A；流速0.3 mL/min；样品室温度4℃；柱温45℃；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾（ESI）电离源，正离子模式；选择多反应监测模式；离子源温度110℃；脱溶剂气温度400℃；脱溶剂气流量（氮气）700 L/h；毛细管电压3.5 kV；锥孔气流量（氮气）50 L/h；碰撞气流量（氩气）0.13 mL/min；扫描范围2～2 000 u。

1.2.5 方法学验证

1）线性范围 称取17 种杂环胺标品各2 mg，用色谱甲醇定容2 mL，得到1 mg/mL HAs 单标母液，稀释10 倍得到100 μg/mL 工作液。将各单标溶液稀释后混合配制为混标溶液，稀释数倍后进行标准曲线测定。以HAs 的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到各HAs质量浓度与峰面积间的线性回归方程。

2）检测限和定量限 将上述不同质量浓度梯度的杂环胺混标溶液添加到空白牛肉饼中，提取后进样检测。当信噪比（S/N）为3 和10 时，所对应的标品质量浓度即此种杂环胺的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

3）精密度 向对照组样品中加入100 μL 一定质量浓度的杂环胺混标溶液，每组样品重复3次，测定杂环胺的含量，所得相对标准偏差（RSD）即精密度。

4）回收率 向对照样品中加入100 μL 一定质量浓度的杂环胺混标溶液，提取并测定。用此结果减去对照组样品中原有的杂环胺含量，所得差值与加入杂环胺标品含量的比值即回收率。

1.2.6 数据统计本试验均做3 次重复，结果以平均值±标准偏差表示。色谱图用Masslynx 软件分析，显著性用IBM SPSS Statistics 22 分析，其它数据用Microsoft Excel 2018 处理。

2 结果与讨论

2.1 方法学研究

17 种杂环胺混标溶液的色谱图见图1，方法学数据见表1。可以看出，除PhIP、去甲哈尔满、Glu-p-1、DMIP 和Phe-p-1 外，其余杂环胺相关系数（R2）均在0.999 以上，表明杂环胺质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。检测限和定量限分别在0.006～0.085 ng/g 和0.020～0.283 ng/g 范围，与文献[23]结果一致。所有标准品的精密度均小于15%，大部分小于10%，表明此方法具有良好的重现性。游离态杂环胺的回收率在49.28%～93.57%之间，结合态杂环胺的回收率在59.88%～83.05%之间，在测量方法的可接受范围内，表明该方法可用于牛肉饼烘烤后HAs 的检测和定量。

图1 17 种HAs 的多反应监测色谱图Fig.1 MRM chromatogram of 17 kinds of HAs

表1 UPLC-MS/MS 定性、定量分析17 种HAs 的线性范围、相关系数、检测限、定量限、精密度和回收率Table 1 Linear range，correlation coefficient，LOD，LOQ，precision and recovery rate of quanlitative and quantitative analysis of 17 kinds of HAs by UPLC-MS/MS

（续表1）

2.2 氨基酸对烘烤牛肉饼基本组分与质构的影响

表2列出4 种氨基酸处理的牛肉饼的基本组分及其质构分析结果。对照组pH 值为6.25 ±0.01，添加组氨酸和赖氨酸的肉饼的pH 值显著高于对照组（P＜0.05），分别达到6.33 ±0.00 和6.36 ±0.01，这可能是因为组氨酸和赖氨酸是碱性氨基酸[24]，它们增加样品的pH 值。

表2 空白组及添加氨基酸组的牛肉饼pH 值和基本组分Table 2 pH values and chemical composition of roast control patties and patties added with amino acids

烤制损失与水分含量呈负相关，说明水分是烤制损失的主要成分。4 种氨基酸均能增加烤制损失，然而差异不显著（P＞0.05）。通常在加热过程中，肉饼中的某些成分参与反应而被消耗，使肉饼变得多孔，促进水分蒸发，增加烤制损失。对照组肉饼与添加氨基酸肉饼的脂肪和矿物质含量差异不显著（P＞0.05）。含氨基酸样品的蛋白质含量高于对照组，可能是因为蛋白质含量是根据总氮含量测定的，而氨基酸中的氮元素可提高该值。

表3列出添加和未添加氨基酸的牛肉饼的质构分析结果。与对照组相比，处理后的肉饼硬度显著提高（P＜0.05），其中甲硫氨酸含量为1.0%的肉饼硬度最高。在加热过程中，肉饼成分之间可能发生一些反应，如美拉德反应，这些成分相互交联，进而使牛肉饼变硬。

表3 空白组及添加氨基酸组的牛肉饼的质构特性Table 3 Texture characteristics of roast control patties and patties added with different levels of amino acids

（续表3）

2.3 氨基酸对烘烤牛肉饼中杂环胺生成的影响

表4列出对照肉饼和含有0.1%，0.5%和1.0%氨基酸的肉饼中游离杂环胺含量。在对照组中检测并定量6 种杂环胺——PhIP、去甲哈尔满、哈尔满、MeIQ、4，8-DiMeIQx 和MeIQx。对照组杂环胺含量为28.49 ng/g，其中以去甲哈尔满含量最多【（16.81 ±0.83）ng/g】，其次为哈尔满【（8.17 ±1.37）ng/g】、PhIP【（1.95 ±0.19）ng/g】、MeIQx【（1.07 ±0.06）ng/g】、MeIQ【（0.27 ±0.02）ng/g】、4，8-DiMeIQx【（0.22 ±0.02）ng/g】。对照样品的杂环胺含量略高于另一项研究[25]，尤其是哈尔满和去甲哈尔满的含量，这可能是2 次试验采用的肉不同所致。除0.5%和1%的甲硫氨酸外，其它氨基酸都在一定程度上抑制总杂环胺的产生，其中1%组氨酸的抑制能力最强，达43.84%。同时，因产生的游离态杂环胺中占比最高，故氨基酸抑制去甲哈尔满和哈尔满能力强，则对总杂环胺的抑制能力也强。针对MeIQx，只有脯氨酸表现出较强的抑制作用，且随着添加量增加，抑制能力也不断增强（57.94%），呈现明显的浓度依赖关系。针对PhIP，只有1%组氨酸，0.1%和0.5%脯氨酸显示抑制作用，均未呈浓度依赖关系。针对去甲哈尔满和哈尔满，可以看出除脯氨酸外，其余3 种氨基酸都呈较好的抑制效果，其中亮氨酸和甲硫氨酸对去甲哈尔满的整体抑制能力都较强，0.5%亮氨酸抑制率为72.40%，1%甲硫氨酸为100%。以上2 种氨基酸都未显示浓度依赖关系，只有组氨酸对去甲哈尔满的抑制显示出浓度依赖（最大抑制率40.10%）。针对哈尔满，组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸都呈现较强的抑制作用，0.5%亮氨酸组抑制率达53.73%，0.1%甲硫氨酸组抑制率达58.26%，而仅组氨酸组呈现浓度依赖关系，且1%组氨酸对哈尔满有最强的抑制能力，达60.59%。综合分析以上数据，组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸对咔啉类杂环胺即去甲哈尔满和哈尔满显示较好的抑制作用，然而仅组氨酸对咔啉呈显著的浓度依赖关系。脯氨酸对MeIQx 有显著的抑制能力，且呈浓度依赖关系。

自由基反应在杂环胺生成中具有非常重要的作用，是杂环胺的主要生成途径之一。大量研究考察了不同抗氧化剂对杂环胺的抑制效果，如葡萄籽和迷迭香提取物[26]、竹叶黄酮[27]和其它一些黄酮[28]的杂环胺抑制能力，被证明分别与其ABTS 自由基、超氧自由基和烷氧自由基的清除能力成正比。

针对β-咔啉的形成，目前明确的途径为Totsuka 等[29]发现的色氨酸与乙醛或α-酮酸通过皮克泰-斯宾格勒反应形成THβC，THβC 通过进一步的氧化、脱羧等反应最终形成β-咔啉。乙醛或α-酮酸是咔啉产生的重要中间体，而该中间体很有可能来自美拉德反应过程中产生的大量自由基，如烷基自由基[30]等。针对喹喔啉类杂环胺（MeIQx）的形成途径，也有报道称自由基是其形成的重要途径[31]。如Milic 等[31]认为美拉德反应和Strecker 降解产生吡啶和吡嗪自由基，该自由基进一步形成相应的吡啶和吡嗪衍生物，最后与肌酸酐反应形成MeIQx 和DiMeIQx 等；Pearson 等[32]提出二烷基吡嗪自由基和肌酸酐可通过加热形成MeIQx 和4，8-DiMeIQx。

HAs总2 8.49 28.11/）（1.33%20.86/）（26.78%16.00/）（43.84%18.38/）（35.49%16.21/（43.1%）16.91/）（40.65%22.49/）（21.06%26.73/）（6.18%28.35/）（0.49%24.84/）（12.81%83.56/）（-193.3%186.47/（-554.51%））（ng/g量含胺环杂态离游中饼肉牛的组酸基氨加添及组白空4表）（ng/g Free heterocyclic amine content of control group and patties added with amino acids Table 4 Glu-AαC DMIP IQx IQ 4，8-DiMeIQx MeIQ满尔哈满尔哈甲去PhIP p-1 nd nd nd nd nd 0.22±0.02 0.27±0.02 8.17±1.37 16.81±0.83 1.95±0.19 nd nd nd nd nd 0.25±0.03 0.43±0.01*7.11±0.14 15.25±0.38*3.91±0.30*）（9.28%nd nd nd nd nd 0.18±0.01*0.71±0.06*4.33±0.28*12.69±0.28*1.96±0.21）（18.18%）（47.00%）（24.51%nd nd nd nd nd nd 0.65±0.04*3.22±0.01*10.07±0.16*1.02±0.07*）（60.59%）（40.1%）（47.69%nd nd nd nd 0.07±0.01*0.49±0.02*0.53±0.01*5.61±0.08*7.40±0.09*2.52±0.13*）（31.33%）（55.98%nd nd nd nd 0.08±0.02*0.61±0.10*0.51±0.04*3.78±0.08*4.64±0.29*4.85±0.06*（53.73%）（72.4%）nd nd nd nd 0.08±0.01*0.64±0.02*0.60±0.04*4.07±0.40*4.79±0.07*4.37±0.11*）（50.18%）（71.51%nd nd nd nd nd 0.37±0.02*0.25±0.03 7.90±0.05 12.07±0.16*1.09±0.06*）（28.2%）（44.10%nd nd nd nd nd nd 0.22±0.01*8.02±1.57 16.85±1.45 1.09±0.17*）（18.52%）（44.10%nd nd nd nd nd nd 0.27±0.02 7.13±0.12 18.15±0.85 2.35±0.12*nd 11.07±0.20*nd nd nd 0.52±0.03*0.40±0.03*3.41±0.19*4.93±0.27*2.93±0.03*）（58.26%）（58.26%nd 64.37±0.69*nd nd nd 0.84±0.03*0.40±0.04*3.88±0.22*5.93±0.68*6.76±0.52*）（52.51%）（52.51%171.98±1.63*nd nd nd nd 0.84±0.07*0.26±0.01 4.84±0.43*nd*（100.00%）7.46±0.04*（40.76%）。率制抑胺环杂为据数内号（P＜0.05），括异差性著显有具较比行进照对的内列一同。*.与差偏准±标值均MeIQx 1.07±0.06组白空1.16±0.04-0.1%酸氨组0.99±0.05-0.5%酸氨组1.04±0.14-1%酸氨组1.76±0.10*-0.1%酸氨亮1.74±0.01*-0.5%酸氨亮2.36±0.06*-1%酸氨亮0.81±0.06*-0.1%酸氨脯）（24.30%0.55±0.00*-0.5%酸氨脯）（48.60%0.45±0.01*-1%酸氨脯）（57.94%-0.1% 1.58±0.01*酸氨硫甲-0.5% 1.38±0.10*酸氨硫甲1.09±0.05-1%酸氨硫甲平为示表据，数行平3次做品：样注

有研究发现，组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和脯氨酸的MRP 的自由基（ABTS）清除活性比单独加热氨基酸产生的物质高13～70 倍[33]。Yu 等[15]表明葡萄糖和组氨酸的MRP 具有强过氧自由基清除活性和较强的抗氧化活性。本试验中，4 种抑制剂氨基酸与肉饼中的糖类结合，产生的MRP 同样可以清除参与杂环胺生成的自由基，这4 种氨基酸抑制剂便可通过自由基消除途径抑制杂环胺的产生。以上假设是否成立，除了自由基途径是否还存在其它抑制途径，以及哪些抑制剂倾向于通过哪些途径抑制杂环胺产生，都未明晰，需进一步研究。接下来的试验将通过建立成分更加简单的模拟体系，监测杂环胺前体，可能目标中间体及其终产物，进而探究不同氨基酸对不同种类杂环胺产生抑制作用的途径和机理。

3 结论

本试验中大部分氨基酸均可不同程度地抑制总杂环胺的产生。组氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸对烘烤牛肉饼中的β-咔啉类杂环胺即去甲哈尔满和哈尔满存在较好的抑制作用，而仅组氨酸对其显示显著的浓度依赖关系。脯氨酸则对MeIQx 有显著的抑制能力，且呈浓度依赖关系。本研究成果期望为通过氨基酸抑制烘烤肉制品中杂环胺的产生提供试验依据。