甲硫氨酸条件性缺乏增加瑞戈非尼对肝癌细胞药物敏感性的研究

吴烨 ，刘晓迪 ，许燕妮 ，罗葆明 *

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，手术切除是其早期比较理想的治疗手段；大多数肝癌起病隐袭，早期症状不明显，发现时多失去手术时机，介入和消融疗效有限，往往需要联合放疗、化疗等方式进行综合治疗［1］。然而中晚期肝癌的化疗效果有限，尤其是对于索拉非尼耐药进展后的肝细胞癌［2］。

二线药物瑞戈非尼（Regorafenib）是一种多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，可抑制肿瘤血管生成、调节肿瘤微环境和抑制肿瘤细胞增殖。瑞戈非尼的问世，较索拉菲尼增加了 2.8 个月生存期［3］，显著提高了生存率。但瑞戈非尼的不良反应较重，56%的患者发生3 级不良反应，11%的患者发生4 级不良反应，以高血压、手足综合征、肝毒性、血液学毒性为主，严重影响患者的生活质量［3］。研究表明［4］，不良反应与治疗剂量有相关性。因此，如何减少瑞戈非尼剂量、增加瑞戈非尼疗效是肝癌研究者关注的问题。

近年来，多个研究报道肿瘤代谢可调控抗肿瘤药物的疗效［5-7］。从饮食中去除氨基酸、丝氨酸和甘氨酸可以重塑肿瘤代谢、调节癌症结果［8，9］。其中，甲硫氨酸（Methionine）是一种必需氨基酸，是人类血浆中发现的最易变的代谢物［10］，在哺乳动物蛋白质合成、DNA 甲基化和多胺合成中具有关键作用。有研究显示，癌症患者减少膳食甲硫氨酸可减缓肿瘤进展。生长培养基中的营养成分对癌细胞代谢的影响显著［11］。因此，本研究在体外水平，通过缺乏甲硫氨酸的培养基模拟甲硫氨酸限制来探讨其是否增加瑞戈非尼的药物敏感性，为临床减少瑞戈非尼剂量，改善患者生活质量、提高有效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肝癌细胞系 Hepa⁃G2 和 Huh7 购自 ATCC。Hepa⁃G2 和 Huh7 根据实验分组用 DMEM（Gibco）培养基或缺乏甲硫氨酸的DMEM 培养基培养。所有细胞系均用含10%FBS（Gibco）和1%青霉素及链霉素（Hyclone）的完全培养基置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养进行实验。

1.2 CCK8 实验检测细胞增殖和IC50 测定

取对数期生长的细胞消化后按5×103细胞种于96 孔板中，置于含5% CO2的37 ℃培养箱中培养，次日根据分组分别换成正常完全培养基组、正常完全培养基+药物组，甲硫氨酸缺乏的完全培养基组，甲硫氨酸缺乏的完全培养基+药物组，根据文献提示［12］，设置药物组的浓度梯度为0，1 nM，10 nM，100 nM、1 μM、10 μM、100 μM、1 mM；培养72 h。通过CCK8 检测瑞戈非尼对细胞增殖能力的影响。使用100 μL 20%CCK8 37 ℃避光孵育2 h，利用吸收光酶标仪（CMAX PLUS）在波长为450 nm处读取吸光值。使用GraphPad Prism 8.0 计算IC50进行后续实验。

1.3 克隆形成实验

将不同分组处理72 h 后的细胞以2000 细胞数种于六孔板中，置于培养箱中培养10~14 天。取出用PBS 清洗一遍后用4%多聚甲醛室温固定20 min，再用0.1%结晶紫溶液室温染色20 min，PBS清洗、37 ℃烘箱风干后拍摄并对细胞克隆团计数。

1.4 细胞周期实验

取对数期生长的细胞消化后按1.5×105细胞种于6孔板中，置于培养箱中培养，贴壁后换上双无培养基饥饿处理24 h，分组处理细胞48 h 后收集细胞，离心弃去培养基，PBS重悬1000 r/min 离心清洗一次，再用0.2 mL PBS 将细胞重悬成单细胞悬液，预制冷70%冰乙醇2 mL 混匀固定4 ℃过夜。次日离心弃去上清，再PBS重悬后离心清洗一遍。细胞沉淀加入 50 μL RNA 酶、450 μL PI 染色液，必要时200 目尼龙网过滤黏连细胞后4 h 内进行流式（BD FACSVerseTM）细胞检测。

1.5 细胞凋亡实验

取对数期生长的细胞消化后按1.5×105细胞种于6 孔板中，置于培养箱中培养，贴壁后处理细胞72 h 后收集每组细胞和上清死细胞，离心后2 mL PBS 重悬清洗一遍。用试剂盒专用Binding Buffer 400 μL 重悬细胞，分取一管细胞不加染料为空白对照管，其余每管加5 μL FITC Annexin V 混匀，避光孵育 15 min 后再加 10 μL/管 PI 试剂，立即进行流式（BD FACSVerseTM）细胞检测。

1.6 细胞线粒体膜电位检测

收集细胞，PBS 清洗一遍后重悬于0.5 mL 细胞培养液中，加入0.5 mL JC⁃1 染色工作液，混匀后37 ℃孵育20 min。600 g 4 ℃离心3~4 min，按照说明书（碧云天C2006）用配制的JC⁃1 染色缓冲液洗涤2 次，再用适量JC⁃1 染色缓冲液重悬，进行流式细胞分析，接收波长为绿光529 nm 和红光590 nm。

1.7 细胞脂质体过氧化检测

按照说明书（Ab243377）向细胞中加入脂质过氧化传感器使之稀释为1X，用H2O2（1M，4000×）处理细胞使终浓度为~250 μM（1×）作为阳性对照，于含5% CO2的37 ℃培养箱中孵育30 min，弃去上清，DPBS清洗3遍收集细胞并用适量体积重悬，2 h内通过FITC/PE通道进行流式细胞检测。

1.8 统计分析

所有实验均重复三次，并使用软件SPSS 21.0.0和GraphPad Prism 8.0 进行统计分析和作图。数据采用均值±标准差表示。P<0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 甲硫氨酸缺乏降低瑞戈非尼在肝癌细胞系的IC50 值

采用CCK8检测瑞戈非尼在两种细胞在不同培养条件下72 h 的IC50 值。HepG2 细胞系在正常培养基中，瑞戈非尼的IC50是5.78 μM，但在甲硫氨酸缺乏培养基中，IC50 显著降低为1.32 μM（P=0.01）（图1A）。在Huh7 细胞系中，甲硫氨酸缺乏培养基较正常培养基IC50 显著降低（9.10 μM，3.22 μM，P=0.005）。因此，甲硫氨酸缺乏能够显著增加瑞戈非尼在这两种肝癌细胞中的敏感性。

图1 甲硫氨酸缺乏协同瑞戈非尼抑制人肝癌细胞系增殖能力

2.2 甲硫氨酸缺乏联合瑞戈非尼显著降低肝癌细胞系的增殖能力

探索甲硫氨酸缺乏或/和瑞戈非尼对肝癌细胞系增殖能力的影响，结果显示，在HepG2和Huh7 细胞系中，甲硫氨酸缺乏培养基不影响HepG2 和Huh7 细胞系的增殖（P>0.05）（图1B）。瑞戈非尼分别在0.1 μM 和1 μM 浓度下，无法显著抑制肝癌细胞增殖，但在甲硫氨酸缺乏培养基中，瑞戈非尼能够显著抑制HepG2 细胞系和Huh7 细胞系的增殖（>50%）。同时，平板克隆实验也显示了相同的结果（图1C）。结果提示，甲硫氨酸缺乏本身对肝癌细胞的增殖无显著影响，但联合瑞戈非尼能够显著抑制肝癌细胞的增殖。

2.3 甲硫氨酸缺乏对瑞戈非尼介导肝癌细胞系的凋亡水平和细胞周期的影响

分析甲硫氨酸是否影响肝癌细胞系的凋亡水平。在HepG2 细胞系中，瑞戈非尼和甲硫氨酸缺乏均可增加细胞晚期凋亡水平，在甲硫氨酸缺乏培养基中加入瑞戈非尼可进一步增加细胞凋亡水平（图2）。而在Huh7 细胞系中，单独使用瑞戈非尼或甲硫氨酸缺乏无法显著增加细胞系凋亡水平，但甲硫氨酸缺乏联合瑞戈非尼可显著增加细胞凋亡水平。

图2 甲硫氨酸缺乏协同瑞戈非尼诱导人肝癌细胞系凋亡

分析甲硫氨酸缺乏对肝癌细胞周期的影响，结果提示（图3），甲硫氨酸缺乏和瑞戈非尼不影响HepG2 细胞系的细胞周期，但在Huh7 细胞系中，两者在抑制细胞周期上起到一定的协同作用。

图3 甲硫氨酸缺乏和或瑞戈非尼对人肝癌细胞系影响的周期实验

2.4 甲硫氨酸缺乏增加瑞戈非尼对线粒体功能的影响

为了进一步探索甲硫氨酸缺乏联合瑞戈非尼抑制肝癌细胞增殖的机制，本研究初步探索了甲硫氨酸缺乏联合瑞戈非尼对HepG2 线粒体膜电位影响。结果提示，瑞戈非尼和甲硫氨酸缺乏均能够降低线粒体膜电位；同时，甲硫氨酸缺乏联合瑞戈非尼表现出协同作用，显著下调线粒体膜电位（图4A）。进一步检测细胞脂质过氧化情况，结果显示瑞戈非尼和甲硫氨酸均可增加细胞膜脂质过氧化水平（图4B），但瑞戈非尼联合甲硫氨酸缺乏对脂质过氧化并无协同作用。

图4 甲硫氨酸缺乏和或瑞戈非尼对人肝癌细胞线粒体功能的影响

3 讨 论

甲硫氨酸是蛋白质合成的基本氨基酸之一，参与细胞生长代谢的多个过程，如组蛋白修饰、叶酸循环、多胺代谢等；同时，甲硫氨酸参与细胞内多种生化反应，包括参与合成半胱氨酸和谷胱甘肽影响氧化、还原平衡、为甲基化反应提供甲基来源等［13］。多项研究也表明，甲硫氨酸在肿瘤细胞中也发挥重要的作用［14］，如：甲硫氨酸限制摄入与细胞毒性化疗药物存在协同抗肿瘤作用［15］；甲硫氨酸参与肿瘤耐药调控［16］，其代谢途径抑制剂可逆转胰腺癌吉西他滨耐药等［17］。本研究发现甲硫氨酸缺乏能够显著增加瑞戈非尼的抗肿瘤效果，从体外水平证明了甲硫氨酸缺乏能够显著增加肝癌细胞系对瑞戈非尼的敏感性。

另外本研究也发现，甲硫氨酸缺乏和瑞戈非尼均可促进脂质过氧化反应但并无协同作用，提示两者联合作用存在除此之外的其他诱导细胞死亡的途径。近年研究者们［18］提出，肝癌细胞分为肝癌上皮来源细胞系和间充质肝癌细胞，而肝细胞核因子4α（HNF4α）决定了肝癌对甲硫氨酸限制的敏感性；使用缺乏甲硫氨酸的培养基会选择性杀死与正常细胞共培养的甲硫氨酸依赖型癌细胞［19］，HepG2、Huh7 细胞系作为高表达HNF4α 的上皮肝癌细胞系对甲硫氨酸限制引起的细胞死亡较HNF4α 阴性细胞具有较弱的抵抗力，并且甲硫氨酸/胱氨酸限制使上皮而非间充质肝癌细胞对索拉非尼诱导的细胞死亡敏感；同时，甲硫氨酸限制也迅速降低谷胱甘肽（GSH）水平，而瑞戈非尼也能通过降低胞内GSH 水平协同GPX4 抑制剂促进细胞铁死亡［20］；本研究结果也表明，甲硫氨酸限制和瑞戈非尼均能够使胞线粒体膜电位下降，提示可能通过影响氧化还原失衡、能量代谢不足而引起细胞死亡［21］，但仍需要更多证据证两者对证明线粒体氧化还原和能量代谢功能的影响。另外，两者联合对两种细胞系的细胞周期生长方面的影响存在差异，提示其对不同细胞作用可能存在差异。

综上所述，本研究在体外实验中验证了甲硫氨酸限制协同瑞戈非尼在杀伤肝癌HepaG2 和Huh7 细胞系和抑制细胞增殖方面，为减低瑞戈非尼临床剂量、提高药效提供理论依据。