钩藤UHPLC指纹图谱及化学模式识别研究

黄雯雯，王晓明，郭亚卿，韩立峰，黄宇虹，潘桂湘*

1天津中医药大学 天津市中药化学与分析重点实验室，天津 301617；2天津中医药大学第二附属医院，天津 300250

2020版《中国药典》收载的钩藤，为茜草科植物钩藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.、大叶钩藤UncariamacrophyllaWall.、毛钩藤UncariahirsutaHavil.、华钩藤Uncariasinensis(Oliv.)Havil.或无柄果钩藤UncariasessilifructusRoxb.的干燥带钩茎枝[1]。目前医药市场上流通的药用钩藤，主要为Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.钩藤。钩藤具有清热平肝，息风定惊的功效，可用于肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫、头痛眩晕等，临床上常用于治疗高血压、心律失常、焦虑、癫痫等疾病[2-4]。钩藤所含化学成分众多，主要含有生物碱类、黄酮类、三萜类等成分[5-7]，其中生物碱被认为是钩藤降压的主要药效组分[8]。

中药指纹图谱是一种综合的、可量化提供化学成分特征的色谱图。就钩藤药材而言，不少学者已开展了一些有关钩藤指纹图谱的研究。例如Huang等[9-11]以钩藤碱和异钩藤碱为指标成分，建立了不同产地钩藤的HPLC色谱指纹图谱，Tan等[12]针对钩藤生物碱部位，建立了钩藤的HPLC指纹图谱。这些研究为深入评价钩藤的质量做出了有益的探索，但囿于研究的关注点主要集中于钩藤碱、异钩藤碱等少数生物碱成分，且只采用了单一的相似度评价，未对指纹图谱数据进行更深层次的挖掘与探讨，在准确全面反映钩藤内在质量方面尚有所不足。

为了更客观、全面、高效地评价钩藤药材质量，本实验通过UHPLC建立了30批不同来源钩藤的指纹图谱研究，利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”标定了15个共有峰，经对照品比对，鉴定出了绿原酸、异帽柱木菲碱、异钩藤碱、钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱7个共有峰。在指纹图谱相似度评价基础上，将指纹图谱数据与化学计量学方法相结合，应用基于化学计量学的聚类分析(cluster analysis，CA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)和正交偏最小二乘-判别分析(orthogonal partial least squares analysis，OPLS-DA)等多元统计方法对钩藤药材质量进行分析评价，以筛选和识别钩藤质量差异的标志性化合物，便于为有效控制钩藤的质量提供参考。

1 仪器和材料

1.1 仪器

Thermo Fisher UHPLC 3000超高效液相色谱仪；AX205型十万分之一天平(Mettler Toledo，Switzerland)；KQ-300B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；3K15型高速离心机(美国Sigma公司)；XW-80A型涡旋混合器(上海沪西分析仪器厂)；Milli-Q超纯水制备仪；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司，天津，中国)。

1.2 试剂

乙腈、甲醇(色谱纯，购于Fisher公司)；甲酸(色谱级，ROE公司)；超纯水由Milli-Q超纯水仪制备。对照品异帽柱木菲碱(批号：B33640)、异钩藤碱(批号：B21526)、钩藤碱(批号：B20453)、去氢毛钩藤碱(批号：B21025)(上海源叶生物科技有限公司)；缝籽嗪甲醚(批号：DST190705)、毛钩藤碱(批号：DST190617-009)、绿原酸(批号：DST181201-021)(成都德思特生物技术有限公司)；以上对照品纯度均 ≥ 98%。

1.3 材料

30批不同来源的市售钩藤收集于湖南、江西、贵州、广西等地，所有样品经天津中医药大学李天祥教授鉴定，表1为不同来源钩藤的具体信息。

表1 钩藤样品信息Table 1 Information of Uncariae Ramulus Cum Uncis

续表1(Continued Tab.1)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm × 100 mm，1.8 μm)，流动相：A相为0.1%甲酸-水，B相为乙腈，梯度洗脱，梯度程序为：0～22 min，5% B→18% B；22～37 min，18% B→25% B；37～47 min，25% B→35% B；47～50 min，35% B→55% B，流速为0.3 mL/min，柱温：30 ℃，进样量为2 μL，检测波长为254 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备

精密称定异帽柱木菲碱、异钩藤碱、钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱、绿原酸适量，分别加入甲醇制成浓度为1 mg/mL的对照品储备液。精密移取各化合物储备液适量，配制成混合对照品溶液，并置于4 ℃冰箱冷藏备用。

2.2.2 供试品溶液制备

取钩藤药材粉末(过三号筛)0.3 g，精密称定，置于10 mL容量瓶中，精密加入75%甲醇定容至刻度线，超声提取(功率250 W，频率50 kHz)40 min，静置至室温后，加75%甲醇补足至刻度线，摇匀后滤过。滤液减压浓缩至干，加入3 mL 75%甲醇复溶，14 000 rpm高速离心20 min，吸取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，并置于4 ℃冰箱冷藏备用。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 精密度实验

取同一批次样品(S5)，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，按照上文所述的色谱条件连续6次进样，以3号色谱峰为参照峰，可测得各个共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均<0.28%，相对峰面积的RSD均<4.73%，结果表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.3.2 稳定性试验

取同一批次样品(S5)，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，按照上文所述的色谱条件分别在时间点0、2、4、8、12、24、48 h下分别进样，以3号色谱峰为参照峰，可测得各个共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均< 0.37%，相对峰面积的RSD均< 3.96%，结果表明样品放置于室温48 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验

取同一批次样品(S5)6份，每份称取0.3 g，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，按照上文所述的色谱条件连续进样，以3号色谱峰为参照峰，可测得各个共有色谱峰的峰面积和相对保留时间，计算得到各共有峰相对保留时间的RSD均<0.26%，相对峰面积的RSD均<4.97%，结果表明供试品制备方法重复性良好。

2.4 不同来源钩藤UHPLC指纹图谱建立

2.4.1 指纹图谱的建立及相似度评价

分别称定30批不同来源的钩藤药材，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，同时按照“2.1”项的色谱条件进行测定，得到30批钩藤药材的UHPLC色谱指纹图谱。采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)”对所得数据结果进行分析，将时间窗宽度设置为0.2 min以避免一些极端数据对于大部分数据造成影响，选取中位数法作为色谱指纹图谱的共有模式图的生成方式，运用多点校正的方法进行了校正，选取S5作为参照色谱图，得到了相应的钩藤特征图谱，和指纹图谱共有模式对照图见图1，相似度评价结果见表2。30批不同来源钩藤样品中有29批样品与对照指纹图谱的相似度在0.919～0.995之间，仅S10样品相似度为0.850，可见大部分药材质量比较接近。

表2 30批样品与对照指纹图谱相似度结果Table 2 Similarity results of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis and control fingerprint

图1 30批样品指纹图谱拟合及共有模式对照图谱Fig.1 UHPLC fingerprints and reference fingerprint of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

2.4.2 特征峰的标定

根据保留时间标定特征指纹峰，对30批钩藤UHPLC指纹图谱测定结果进行比较分析，发现15个特征峰是30批钩藤共有的，因此确定这15个峰为特征指纹峰。通过对照品比对，确定3号峰为绿原酸、7号峰为异帽柱木菲碱、8号峰为异钩藤碱、10号峰为钩藤碱、12号峰为缝籽嗪甲醚、13号峰为去氢毛钩藤碱、14号峰为毛钩藤碱。钩藤药材(S5为例)样品和混合对照品的UHPLC图谱见图2。

图2 钩藤样品(A)和混合对照品(B)的UHPLC图谱Fig.2 UHPLC chromatograms of Uncariae Ramulus Cum Uncis (A) and mixed standards (B)注：3：绿原酸；7：异帽柱木菲碱；8：异钩藤碱；10：钩藤碱；12：缝籽嗪甲醚；13：去氢毛钩藤碱；14：毛钩藤碱。Note:3:Chlorogenic acid;7:Isomitraphylline;8:Isorhynchophylline;10:Rhynchophylline;12:Geissoschizine methylether;13:Hirsuteine;14:Hirsutine.

2.4.3 聚类分析

以钩藤样品中15个共有峰的相对峰面积为变量，得到30×15原始数据矩阵，运用SPSS 24.0分析软件，采用组间联接法结合欧式距离平方对样品进行聚类分析，结果见图3。当分类距离为20时，S10样品为一类，其余样品聚为一大类；当分类距离为5时，S10样品为一类，S20样品为一类，S1、S6、S14、S15、S22、S29样品聚为一类，S9、S12、S16、S17样品聚为一类，其余样品聚为一大类。

图3 钩藤样品聚类分析树状图Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

2.4.4 主成分分析与正交偏最小二乘-判别分析

将指纹图谱中所得到的30 批钩藤样品共有峰的峰面积导入SIMCA14.1软件绘制主成分分析得分图，Par作为标度化方式(见图4)。PCA结果与聚类分析基本一致。在载荷散点图中(见图5)，每一个点代表一个色谱峰，其在坐标系中距离原点(0，0)距离的远近，表明该成分对样品分类的贡献的作用程度。其中1号、3(绿原酸)、6号、7(异帽柱木菲碱)、9号、12(缝籽嗪甲醚)、14号(毛钩藤碱)号色谱峰在坐标系中的绝对值较大，表明这几个成分对样品整体分布起主要影响。

图4 30批样品主成分分析图Fig.4 Principal component analysis plot of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

图5 30批样品主成分载荷图Fig.5 Loading plot of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

为进一步筛选出对上述样品分类贡献较大的成分，采用正交偏最小二乘判别分析结合变量投影重要度(variable importance for the projection，VIP)，以VIP > 1.0为筛选标准对数据进行处理分析，共得到贡献相对较大的5个变量色谱峰(见图6)。按照变量投影重要度值大小依次为3号峰(绿原酸，VIP=2.172 3)> 12号峰(缝籽嗪甲醚，VIP=1.476 4)> 1号峰(VIP=1.227 9)> 9号峰(VIP=1.141 5)> 7号峰(异帽柱木菲碱，VIP=1.138 3)。该结果与主成分载荷图分析结果大体一致，提示这几个成分是样品之间产生差异的主要原因，具有一定的标志性作用。为了更加全面、高效地评价药物质量，在以后对钩藤的研究中，应对上述成分引起关注。

图6 30批钩藤样品各成分VIP图Fig.6 VIP diagram of various constituents of 30 batches of Uncariae Ramulus Cum Uncis

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方式和色谱条件优化

本研究分别考察了药材提取时间(超声20、40、60 min)、提取溶剂(100%、75%、50%甲醇和100%、75%、50%乙醇)、色谱柱(ACQUITY UPLC HSS T3、Cortecs UPLC T3、Cortecs UPLC C18和ACQUITY UPLC BEH C18)、不同的流动相体系(甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液)对色谱峰数量及分离情况的影响，最终确定75%甲醇超声提取40 min作为供试品制备方法，色谱柱选用ACQUITY UPLC HSS T3，以乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱。同时考察了254、274、366 nm等不同的检测波长，发现254 nm处的色谱图峰较多且分离度良好。

3.2 市售钩藤的指纹图谱一致性比较

2020版中国药典对钩藤药材的质量控制，以异钩藤碱为指标成分采用TLC法进行定性鉴别。该法操作较为繁琐、灵敏度较低，要对钩藤的质量进行较全面的控制较为困难。本研究首先对30批不同市售来源的钩藤建立指纹图谱进行相似度评价，随后对其进行化学模式识别研究。经相似度评价软件计算，结果显示30批钩藤药材相似度在0.850～0.995之间；指纹图谱共确定15个共有峰，经过对照品的比对指认了7个化学成分，分别为绿原酸、异帽柱木菲碱、异钩藤碱、钩藤碱、缝籽嗪甲醚、去氢毛钩藤碱、毛钩藤碱。绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、降压等[13,14]广泛的药理作用；异帽柱木菲碱对人淋巴细胞白血病T细胞具有抗增殖作用[15]；异钩藤碱和钩藤碱是钩藤治疗高血压的主要活性成分[16]；缝籽嗪甲醚为有效的5-HT1A受体的激动剂，是传统日药抑肝散的主要成分[17,18]；去氢毛钩藤碱是神经细胞保护作用的有效成分[19]；毛钩藤碱具有抗癌作用[20]，在体外可抑制人乳腺癌MCF-7细胞活力，并诱导DNA损伤反应和氧化应激反应[21]。采用无监督的聚类分析、主成分分析进一步将30批样品分为不同组别，在对钩藤药材品质一致性评价的同时进行差异性评价；并通过正交偏最小二乘判别分析筛选对样品分组影响较大的色谱峰。通过指纹图谱相似度评价和模式识别方法相结合，我们发现导致批次间差异的主要是1、3(绿原酸)、7(异帽柱木菲碱)、9、12(缝籽嗪甲醚)这几个成分引起的，提示在对钩藤药材质量进行评价时应重点关注这几个差异成分。1号、9号色谱峰，有必要结合质谱、核磁等技术或采用相关对照品，进一步加以指认。

4 结论

采用化学模式识别技术结合指纹图谱的数据进行分析，可以更加客观完整的评价中药的真伪与优劣。本实验采用指纹图谱相似度评价和化学模式识别技术相结合的方法对不同来源的钩藤进行研究，与已有仅以含量测定或指纹图谱的品质评价与质量控制方法相比，不仅可有效评价钩藤药材品质的一致性，同时还可阐明钩藤药材品质差异形成的主要因素，因而为钩藤的品质评价与质量控制提供了更为丰富的信息，为钩藤的质量控制和后续开发提供了一定参考。