川芎挥发油羟丙基-β-环糊精包合物的制备及其性能研究

杨玉婷，刘云华，刘玉红，黄志芳，陈 燕，易进海*

1成都中医药大学药学院，成都 611137；2四川省中医药科学院 中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室，成都 610041

川芎为伞形科藁本属植物LigusticumchuanxiongHort. 的干燥根茎，其味辛、微苦、性温，具有活血行气、祛风止痛等功效，被誉为“血中之气药”，用于胸痹心痛，跌扑肿痛，月经不调，癥瘕腹痛，风湿痹痛等症[1]。川芎挥发油(川芎油)是川芎的重要有效组分之一，主要有效成分为藁本内酯，具有很强的解痉、平喘、镇静等作用[2]，临床上治疗偏头痛和缺血性脑血管疾病等有效[3,4]。但藁本内酯的化学性质不稳定，易发生脱氢、氧化、水解、降解等多种异构化反应[5]，此外，川芎油水溶性低及口服生物利用度较差，极大地限制了其在临床上的应用。为解决川芎油稳定性及溶解度的问题，已报道的制剂方法有：软胶囊、滴丸、鼻腔喷雾剂、微乳、环糊精包合等[3,6]。环糊精包合是一种常用的制剂手段，羟丙基-β-环糊精(hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD)是应用最广泛的环糊精衍生物之一，也是FDA第一个批准可供注射的β-环糊精(β-cyclodextrin，β-CD)衍生物[7]。HP-β-CD是由β-CD与环氧丙烷缩合得到的亲水性衍生物，由于β-CD的羟丙基化破坏了其分子内氢键，HP-β-CD水溶性显著提高(75% W/W)，同时又保留了β-CD的包合能力，极大地扩宽了母体β-CD的应用范围，具有提高药物的溶解度、稳定性和生物利用度，降低药物的刺激性或毒性等作用[8]。

目前中药挥发油的包合材料大多选用β-CD，一般采用饱和水溶液法制备包合物[6,9]，但收率较低且水溶性差。采用高水溶性的HP-β-CD制备包合物，收率高且水溶性好，常规制备方法有水溶液法、研磨法和超声法，该3种方法均在水相中进行，需搅拌、研磨或超声处理，效率低且不易干燥[10-12]。Ao等[13]以无水乙醇为溶剂，采用旋转蒸发器制备川芎油HP-β-CD包合物，用旋转代替传统的搅拌工序，但无水乙醇和旋转工序难以应用于工业化大生产。其次，该研究采用乙酸乙酯回流提取川芎油，以得到的川芎油重量计算包合率，需要的包合物量大，且提取不完全，精准度差。此外，该研究未对包合物进行表征、溶解度及稳定性评价。本实验基于大生产的可行性和实用性，拟以85～95%乙醇为溶剂，采用单相法制备川芎油HP-β-CD包合物，无需搅拌、研磨等工序，直接回收浓缩干燥，该方法简便易操作，且收率和包合率高；研究确定了包合物提取和洗脱方法，采用HPLC准确测定包合率，正交试验法优化包合工艺，对包合物进行表征、溶解度和稳定性考察，为川芎油制剂的生产应用提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；KQ-300E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；R-3旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)；Apreo S型扫描电镜(美国赛默飞世尔科技公司)；Cary 600 FTIR光谱仪(美国Agilent公司)；ZKF035型电热真空干燥箱(上海实验仪器厂有限公司)；SOP型电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；Milli-Q Integral 3型超纯水机(美国Millipore 公司)；DNP-9052型电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；IKA C-MAG HS7型加热磁力搅拌器(德国IKA公司)；SoRVALL ST16R高速离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；ZD-85型气浴恒温振荡器(常州国宇仪器制造有限公司)。

川芎油(实验室自制，藁本内酯、洋川芎内酯A的含量分别为50.30%和16.77%)；HP-β-CD(批号：HP20200313，山东滨州智源生物科技有限公司)；对照品丁苯酞(批号：101035-201903，中国食品药品检定研究院)；无水乙醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；甲醇(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；石油醚(沸程：60～90 ℃，分析纯，成都市科龙化工试剂厂)；甲醇(色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；水(超纯水，Milli-Q Integral 3超纯水机制得)。

2 方法与结果

2.1 包合物的制备

2.1.1 HP-β-CD包合物的制备

称取HP-β-CD适量，溶于适量95%乙醇中，按规定比例加入川芎油，混合均匀后，70 ℃减压回收乙醇、干燥。研磨、过80目筛，得淡黄色包合物粉末。

2.1.2 HP-β-CD物理混合物的制备

称取HP-β-CD适量于研钵中，缓慢加入适量川芎油，轻轻研匀，得淡黄色物理混合物粉末。

2.2 含量测定

采用本课题组建立报道的方法[14]，以丁苯酞为对照品，一测多评法测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A的含量，藁本内酯、洋川芎内酯A对丁苯酞的校正因子分别为0.226 3、0.490 7。

2.2.1 色谱条件[14]

采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(52∶48)；柱温35 ℃；检测波长280 nm；流速1.0 mL/min；进样量5 μL。色谱图见图1。

图1 对照品溶液(A)、川芎油HP-β-CD包合物(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and Chuanxiong Rhizoma volatile oil-HP-β-CD inclusion complex (B)注：1.洋川芎内酯A；2.丁苯酞；3.藁本内酯。Note: 1.Senkyunolide A;2.Butylphthalide;3.Ligustilide.

2.2.2 对照品溶液的制备

取丁苯酞对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含204.8 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备

取包合物粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 包合率的测定

包合率为衡量包合效果的主要指标，包合率越高，挥发油被包合的效果越好。若要准确地测定包合率，需要选择测定包合物总药量的提取溶剂和未包合药量的洗脱溶剂。本实验以川芎油中主要成分藁本内酯和洋川芎内酯A的包合率之和为评价指标，根据藁本内酯和洋川芎内酯A在川芎油中的含量，两种成分包合率的权重系数分别为0.75、0.25。对包合率测定中几种常用的溶剂进行考察筛选，确定了准确测定包合率的方法。

藁本内酯包合率Y1=

(1)

洋川芎内酯A包合率Y2=

(2)

包合率=Y1×0.75+Y2×0.25

(3)

2.3.1 包合物提取溶剂的考察

参考文献方法[13,15]，包合物常采用无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、水蒸气蒸馏等提取其药物成分。预实验结果显示，为确保包合物中药物成分提取完全，需选用极性大的提取溶剂。按“2.2.3”项下方法操作，保持其他条件不变，分别考察70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇和甲醇对包合物的提取效果，同法回流提取。结果见表1，各溶剂、超声和回流提取效果均无明显差异，RSD均小于1%，综合考虑简便性和经济实用性，选择70%乙醇作为包合物的提取溶剂。

表1 不同溶剂超声和回流提取结果(n=3)Table 1 Ultrasonic and reflux extraction results by using different solvent (n=3)

2.3.2 包合物洗脱溶剂的考察

参考文献方法[6,15,16]，未包合物的洗涤常使用石油醚、环己烷、乙酸乙酯、乙醇、蒸馏水等。洗脱溶剂需将包合物中未包合的药物充分洗涤，且不使包合物脱包。预实验结果显示，石油醚极性小，能溶解川芎油，且不使包合物脱包，故采用石油醚对未包合物进行洗脱，并对洗脱次数进行考察。

取包合物粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入石油醚25 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，滤渣用石油醚洗涤3次，每次3 mL，滤液和洗液合并，40 ℃减压回收石油醚，精密加入95%乙醇10 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。滤渣再次加入石油醚25 mL，同上操作4次。结果见表2，第3次和第4次提取药量极低，故采取石油醚超声提取两次测定未包合药量。

表2 石油醚不同洗脱次数提取结果Table 2 Extraction results of petroleum ether with different elution

综上所述，确定包合率的测定方法：按“2.2.3”项下方法操作，测得包合物总药量；再按“2.3.2”项下方法操作，石油醚提取两次，测得未包合药量。按公式(1)、(2)、(3)计算包合率。

2.4 制备方法筛选

文献报道HP-β-CD包合挥发油的常见方法主要有水溶液法、研磨法和单相法[10-12]，故对该3种方法进行考察，筛选出较为合适的包合物制备方法。预实验结果显示，水溶液法在滴加川芎油时，于边超声边搅拌的情况下包合率更高，故将水溶液法改进为水溶液超声搅拌法。

2.4.1 水溶液超声搅拌法

按川芎油和HP-β-CD的质量比为1∶10，称取HP-β-CD溶于2倍蒸馏水中，于边超声边搅拌的条件下，将川芎油(用等量95%乙醇稀释)缓慢滴加至HP-β-CD水溶液中，混合均匀，磁力搅拌2 h(温度30 ℃，搅拌速度750 rpm)，分别于70 ℃减压回收、干燥。平行制备3份，平均包合率为84.54%±0.34%。

2.4.2 研磨法[11]

按川芎油和HP-β-CD的质量比为1∶10，称取HP-β-CD于研钵中，加入少量水研磨至面糊状，缓慢滴加川芎油(用等量95%乙醇稀释)，继续研磨45 min，转移至蒸发皿中，70 ℃减压干燥。平行制备3份，平均包合率为88.37%±1.58%。

2.4.3 单相法[12]

按川芎油和HP-β-CD的质量比为1∶10，称取HP-β-CD溶于2倍95%乙醇中，将川芎油滴加至HP-β-CD乙醇溶液中，混合均匀，分别于70 ℃减压回收、干燥。平行制备3份，平均包合率为91.17%±0.21%。

根据以上结果，单相法制备的包合物的包合率最高，且方法简便易操作，故选择单相法制备川芎油HP-β-CD包合物。

2.5 单因素考察

2.5.1 乙醇体积分数

按“2.4.3”项下方法，保持其他条件不变，考察乙醇体积分数80%、85%、90%、95%、100%对包合率的影响。结果见图2，随着乙醇体积分数的增加，包合物包合率增加，综合考虑包合率和成本效益，选择乙醇体积分数85%、90%、95%进行正交试验。

2.5.2 投料比

按“2.4.3”项下方法，保持其他条件不变，考察川芎油与HP-β-CD的质量比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15对包合率的影响。结果见图2，随着投料比的增加，包合物包合率增加，综合考虑包合率和辅料用量，选择投料比1∶6、1∶8、1∶10进行正交试验。

2.5.3 HP-β-CD与乙醇的质量体积比

按“2.4.3”项下方法，保持其他条件不变，考察HP-β-CD与乙醇的质量体积比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5对包合率的影响。结果见图2，随着HP-β-CD与乙醇的质量体积比的增加，包合物包合率增加的幅度较小，综合考虑包合率和成本效益，选择HP-β-CD与乙醇的质量体积比1∶1、1∶3、1∶5进行正交试验。

图2 不同因素对包合率的影响Fig.2 The influence of different factors on the inclusion rate

2.6 正交设计优选包合工艺

考察因素为乙醇体积分数、川芎油与HP-β-CD的质量比、HP-β-CD与乙醇的质量体积比，每个因素选取3个水平，以包合率为评价指标，采用L9(34)正交表安排试验，试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 正交实验设计与结果Table 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由直观分析可知，各因素对实验结果的影响大小为A>B>C。方差分析结果表明，A因素存在极显著性差异(P<0.01)，为最重要影响因素；B因素存在显著性差异(P<0.05)，为主要影响因素；C因素无显著性差异，为次要影响因素。综合考虑成本与效益，确定最佳制备工艺为A3B3C2，即乙醇体积分数95%，油∶HP-β-CD(g/g)为1∶10，HP-β-CD∶乙醇(g/mL)为1∶3。

按优选的包合工艺制备3批包合物，包合率分别为92.17%、92.62%、92.23%，平均包合率为92.34%，RSD为0.26%，结果重现性好，该工艺稳定可行。

2.7 川芎油包合物的表征

2.7.1 扫描电镜观察(SEM)

分别取HP-β-CD、川芎油HP-β-CD物理混合物和川芎油HP-β-CD包合物适量，经导电胶粘样、喷金镀膜后，观察其形貌特征。由图3可知，HP-β-CD呈中空圆球状，物理混合物中川芎油呈小颗粒分散在HP-β-CD的表面及四周，而包合物中川芎油成分分子进入到HP-β-CD分子空腔内，使HP-β-CD发生形态学变化，转呈棱状，表明包合物形成。

图3 样品SEM图(×500)Fig.3 SEM image of samples (×500) 注：A.HP-β-CD；B.川芎挥发油HP-β-CD物理混合物；C.川芎挥发油HP-β-CD包合物。Note: A.HP-β-CD;B.Chuanxiong Rhizoma volatile oil-HP-β-CD physical mixture;C.Chuanxiong Rhizoma volatile oil-HP-β-CD inclusion complex.

2.7.2 红外光谱分析(IR)

分别称取川芎油、HP-β-CD、川芎油HP-β-CD物理混合物和川芎油HP-β-CD包合物适量，其中川芎油采用KBr涂片法，其余采用KBr压片法，分辨率4 cm-1，光谱范围4 000 ～400 cm-1全谱扫描，结果见图4。川芎油的红外图谱(A)于1 761 cm-1出现羰基特征峰，为川芎油中内酯类成分；HP-β-CD(B)在3 395 cm-1处出现多缔合体羟基的伸缩振动；物理混合物(C)中羰基吸收峰(1 762 cm-1)明显存在；包合物(D)中羰基吸收峰消失，羟基吸收峰位移至3 412 cm-1，可能与川芎油成分分子进入到HP-β-CD分子空腔中，破坏了其分子内氢键有关[17]，使得缔合羟基向高频移动。以上波数变化说明包合物已形成。

图4 样品IR图Fig.4 IR image of samples 注：A.川芎油；B.HP-β-CD；C.川芎挥发油HP-β-CD物理混合物；D.川芎挥发油HP-β-CD包合物。Note: A.Chuanxiong Rhizoma volatile oil;B.HP-β-CD;C.Chuanxiong Rhizoma volatile oil-HP-β-CD physical mixture;D.Chuanxiong Rhizoma volatile oil-HP-β-CD inclusion complex.

2.8 川芎油HP-β-CD包合物的性能研究

2.8.1 相溶解度法

称取适量HP-β-CD，加蒸馏水分别配制为0、10、20、30、40、50、60 mmol/L的溶液各10 mL，分别加入过量川芎油，于35 ℃,120 rpm气浴恒温振荡器振摇48 h。待溶液平衡，常温条件下12 000 rpm离心10 min，取上清液，滤过，取续滤液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。以HP-β-CD浓度X(mmol/L)为横坐标，藁本内酯和洋川芎内酯A的浓度Y(mmol/L)为纵坐标作图，绘制相溶解度曲线，见图5。对曲线进行线性回归，得回归方程。根据Higuchi和Connors提出的理论[18]，按公式(4)、(5)计算增溶倍数和平衡常数K，增溶倍数结果见表5。

表5 不同浓度HP-β-CD对川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A的增溶倍数(T=35 ℃)Table 5 The solubilization multiples of different concentrations of HP-β-CD onLigustilide and Senkyunolide A in Chuanxiong volatile oil (T=35 ℃)

图5 川芎油HP-β-CD相溶解度图Fig.5 Chuanxiong Rhizoma oil HP-β-CD phase solubility diagram

由相溶解度曲线判断，在试验选取的浓度范围内，藁本内酯、洋川芎内酯A浓度随着HP-β-CD浓度呈线性增长，包合类型为AL型，可形成摩尔比为1∶1的可溶性包合物，得到的回归方程分别为Y= 0.137 8X+ 0.531 1(R2= 0.997 1)，Y= 0.078 7X+ 0.519 5(R2= 0.994 3)。包合物中藁本内酯和洋川芎内酯A的平衡常数K分别为300.93、164.42，说明形成的包合物较稳定，HP-β-CD对川芎油有较好的包合效果。在试验选取的浓度范围内，藁本内酯和洋川芎内酯A的最大增溶倍数可达15.57、10.80。

(4)

(5)

式中S为川芎油在HP-β-CD溶液中的溶解度，S0为川芎油在水中的饱和溶解度。

2.8.2 加速热稳定性试验

川芎油在储存过程中不稳定，温度、氧气、pH和光照均对其稳定性有影响，温度为主要影响因素[19,20]。故对包合物的热稳定性进行考察。

分别称取适量川芎油、HP-β-CD物理混合物和HP-β-CD包合物于密闭洁净容器中，摊成≤5 mm厚的薄层。置于60 ℃恒温培养箱中，考察10天，于第0、5、10天取样，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，计算样品与第0天的相对保留率。结果见表6，HP-β-CD包合物相比物理混合物和川芎油的稳定性有显著性改善。

表6 川芎油包合物热稳定性试验结果Table 6 Thermal stability test results of Chuanxiong Rhizoma oil inclusion complex

3 讨论

本实验采用单相法进行包合，川芎油一次性加入HP-β-CD的乙醇溶液中，且无需研磨、搅拌或超声处理，直接减压回收、干燥即得包合物。该方法简便、实用、收率高，适合于工业化大生产。

藁本内酯和洋川芎内酯A尚无法定的含量测定用对照品，且不稳定，对照品纯度标定和保存困难，故本课题组前期建立了以丁苯酞为对照品，一测多评法测定川芎油中藁本内酯和洋川芎内酯A的含量，该方法简便可行[14]。本文对含量测定方法学进行了考察，专属性、线性、精密度、稳定性和重复性等符合定量分析的要求。

关于包合率的测定，文献报道一般以洗涤后的包合物测得的药物量除以实际投入量为包合率。洗涤操作常在制备包合物过程中用水或有机溶剂淋洗抽滤后的滤饼，或采用有机溶剂萃取包合物溶液[6,9,10,16]，二者均会使包合物脱包，测得包合率偏低。此外，另有文献报道采用水蒸气蒸馏法[9,10,12,16]提取包合物中的挥发油，该方法挥发油定量提取不完全，导致测得包合率偏低，且重现性差。本实验经比较研究，采用极性大的70%乙醇提取测定包合物总药量，再以极性小的石油醚提取测定未包合药量，包合物总药量减去未包合药量即为真实的包合物药量，该方法能更准确地测定包合率。

HP-β-CD相溶解度曲线在一定浓度范围内呈线性增长，藁本内酯斜率大于洋川芎内酯A，表明HP-β-CD对藁本内酯的增溶效果更好。此外，本实验对川芎油β-CD包合物也进行了相溶解度的考察，在相同的试验浓度范围内，其相溶解度曲线呈非线性增长，藁本内酯和洋川芎内酯A的增溶倍数分别为2.36、2.95，远低于HP-β-CD，与文献报道一致[21]，表明HP-β-CD包合物具有明显的优势。川芎油HP-β-CD包合物的生物利用度及药理学活性等有待进一步实验研究。