九蒸九晒熟地黄中的紫罗兰酮类化合物

张靖柯，吕锦锦，李 孟，魏俊俊，郑晓珂，冯卫生

河南中医药大学 河南省中药开发工程技术研究中心，郑州 450046

地黄是玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根，在中国传统用药中具有几千年的药用历史。产地主要集中在河南、山西、山东等地，以河南焦作为其道地产区，目前各地也多有栽培。在临床用药中，地黄有鲜地黄，生地黄以及熟地黄三种饮片形式，其临床应用以及药性药效均存在较大的差异。鲜地黄味甘，性苦、寒。归心、肝、肾经。具有清热生津，凉血止血的功效。生地黄味甘性寒。归心、肝、肾经。具有清热凉血，养阴生津的功效。熟地黄Rehmanniae Radix Praeparata为生地黄的炮制加工品，味甘性微温，归肝、肾经。补血滋阴，益精填髓[1]。前期课题组对鲜地黄、地黄叶以及生地黄都进行了系统的化学成分研究[2-6]，并且从九蒸九晒熟地黄中也分离得到了6个生物碱类化合物[7]。目前研究报道熟地黄主要含有多糖类[8]，苯乙醇苷类[9]、核苷类[10]、环烯醚萜类[11]、紫罗兰酮类[12]以及多种微量元素等化合物。熟地黄现代药理活性主要表现为抗肿瘤、抗氧化应激、抗抑郁和抗突变[13-16]等方面的作用。

紫罗兰酮类化合物广泛存在于地黄属植物中，具有环化异戊二烯结构单元，有较强的抗肿瘤活性[17,18]。有研究表明[19]紫罗兰酮类化合物对鼠黑色素瘤(B16)细胞具有抑制作用。因此本实验对从九蒸九晒熟地黄中分离得到的紫罗兰酮类化合物进行了人黑色素瘤A375细胞细胞毒活性的筛选研究。丰富和完善了“九蒸九晒”熟地黄的相关化学成分研究，并为其开展进一步的抗肿瘤研究提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器

Bruker AVANCE Ⅲ 500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)；Bruker maxis HD mass spectrometer,Shimadzu UV-2401PC apparatus；Waters Alliance系列2695高效液相系统；Thermo NicoletIS 10红光谱仪(美国)；旋光仪(Rudolph，美国)；Thermo EVO 300紫外分光光度计(Thermo Scientific，美国)；LC-52半制备液相色谱仪(赛普锐思科技有限公司)；Reprosil-Pur120 C18-AQ色谱柱(德国)；CHIRALPAK AD-H色谱柱(大赛璐药物手性技术有限公司)；旋转蒸发仪(日本，东京理化)；二氧化碳培养箱(上海STIK)；超净工作台(苏净集团)；倒置显微镜(Nikon)。

1.1.2 试剂

柱层析填料Diaion HP-20(日本，三菱化学公司)；Toyopearl HW-40(日本，TOSOH公司)；Sephadex LH-20(瑞士，Parmacia Biotech公司)；柱层析用硅胶(100～200、200～300目)、薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂)。

甲醇(色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司)；甲醇(分析纯，天津市富宇化工有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；A375人恶性黑色素瘤细胞株(中国科学院上海细胞库)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)；培养皿(Corning)；E-Plate板96孔板；胰蛋白酶；DMEM高糖培养基(Gibco)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；DMSO(Solarbio)；PBS缓冲液等为自配。

1.1.3 药材

本实验所用熟地黄2017年8月购自河南省禹州市青山药业有限公司(经九蒸九晒方法炮制)，标本(编号20170907)存放于河南中医药大学药物化学实验室。

1.2 实验方法

1.2.1 提取和分离

干燥熟地黄饮片10 kg，剪碎后加10倍量70%的含水丙酮加热回流提取3次，提取液过滤，合并滤液进行减压浓缩，真空干燥，得到熟地黄总提取物浸膏4.4 kg。将总提物浸膏加3 L水溶解分散，加95%乙醇调节至醇浓度80%进行醇沉，静置24 h后，取上清液，减压浓缩得到总浸膏。浸膏加8 L水溶解，然后经Diaion HP-20大孔吸附树脂柱，依次用水、10%、20%、30%、50%、70%以及95% EtOH进行梯度洗脱，得到7个洗脱组分，即Fr.1～Fr.7。20% EtOH(Fr.3)水溶解后用Sephadex LH-20凝胶柱[甲醇∶水(V/V)=0∶100→100∶0] 梯度洗脱，洗脱组分经薄层硅胶色谱检识，合并相同组分得到Fr.3-1～Fr.3-4。其中Fr.3-1组分5%甲醇溶解用中压制备(ODS)柱，甲醇-水系统进行梯度洗脱得到Fr.3-1-1～3-1-3。Fr.3-1-2经半制备液相Reprosil-Pur 120 C18-AQ色谱柱(CH3CN∶H2O=12∶88)流速为：3 mL/min，保留时间(tR=27.87 min)洗脱得到化合物1(3.40 mg)。Fr.3.3溶解后经Toyopearl HW-40C凝胶柱，30%甲醇洗脱得到Fr.3-3-1～Fr.3-3-4。Fr.3-3-2用半制备液相Reprosil-Pur120 C18-AQ色谱柱(CH3CN∶H2O=10∶90)流速：3 mL/min，保留时间(tR=21.36 min)得到化合物2(4.23 mg)。95% EtOH洗脱组分(Fr.7)甲醇溶解后上硅胶柱。用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇依次洗脱得到Fr.7-1～Fr.7-4。其中Fr.7-1经Sephadex LH-20凝胶柱甲醇洗脱，得到Fr.7-1-1。Fr.7-1-1甲醇溶解，进行硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(40∶1)等度洗脱，最终得到化合物3(7.91 mg)。

1.2.2 细胞毒活性检测

采用MTT法探究化合物1～3对A375人恶性黑色素瘤细胞株的细胞毒作用[20]。将A375细胞置于培养基中37 ℃，5% CO2培养箱中培养至对数生长期，接种于E-Plate 96孔板中，24 h后，实验分为正常对照组和三个给药组。化合物1～3(25 μM)分别刺激A375细胞48 h，通过MTT法检测各组细胞活力。

1.2.3 统计学分析

利用SPSS 20.0进行数据统计学分析。数据以平均值±标准差表示，分析数据显著性差异，P< 0.01表明具有极显著性差异。

2 结果

2.1 结构鉴定

2.1.1 化合物结构鉴定

化合物1无色结晶性粉末； -64.0(c0.02，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z469.203 9 [M+Na]+(calcd for C21H34O10Na，469.204 4)确定化合物的分子式为C21H34O10；UVλmax(CH3OH)/nm(logε)197(0.35)，263(1.05)；IRνmax：3 387、2 929、1 679、1 522、1 459、1 263、1 078、849 cm-1；IR光谱提示存在羟基(3 387 cm-1)和羰基信号(1 611 cm-1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)：δ6.68(1H，d，J=16.1，H-7)和6.39(1H，d，J=16.1 Hz，H-8)提示化合物中存在一个反式双键；δH5.80(1H，s，H-10)推测为双键上的氢信号；δH1.03(3H，s，1α-CH3)、0.89(3H，s，1β-CH3)、0.96(3H，s，5-CH3)以及2.30(3H，s，9-CH3)为四个甲基氢信号；δH4.30(1H，d，J=7.8 Hz,H-1′)为糖的端基氢信号，δH3.85(1H，d，J=11.8 Hz，H-6′a)和3.67(1H，dd，J=11.8，5.3 Hz，H-6′b)为葡萄糖6位特征氢信号，结合δH3.18～3.73(4H，m，H-2′～5′)推测该化合物中存在一个葡萄糖的结构片段。根据偶合常数J=7.8 Hz，判断该葡萄糖为β构型。13C NMR(125 MHz，CD3OD)共显示21个碳信号，结合DEPT 135谱可知，δC18.8(1α-CH3)、22.7(1β-CH3)、26.9(5-CH3)和14.3(9-CH3)为4个甲基信号；δC27.0(C-3)，35.9(C-4)，62.8(C-6′)为3个仲碳信号；δC85.4(C-2)，139.3(C-7)，134.6(C-8)，119.7(C-10)，106.6(C-1′)，75.4(C-2′)，78.2(C-3′)，71.7(C-4′)，77.7(C-5′)为9个叔碳信号；δC45.2(C-1)，75.6(C-5)，82.4(C-6′)，153.8(C-9)，170.7(C-11)为5个季碳信号；其中δC170.7为-COOH的特征碳信号，结合其信号特征，推测该化合物可能为倍半萜苷类化合物(见图1)。将其碳谱数据与文献[21]中sec-hydroxyaeginetic acid进行对比，发现化合物1中多一组葡萄糖的碳信号(δC106.6、75.4、78.2、71.7、77.7、62.8)且δC74.5(C-2)处的碳信号向低场区发生位移至δC85.4处，根据苷化位移以及HMBC谱，葡萄糖端基氢δH4.30(H-1′)与δC85.4(C-2)处的碳远程相关(见图2)，确定葡萄糖连接在sec-hydroxyaeginetic acid苷元的C-2位上。

图1 化合物1的化学结构Fig.1 The chemical structures of compound 1

图2 化合物1的HMBC、1H-1H COSY相关Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1的相对构型主要是通过NOESY谱进行确定。在NOESY谱中，δH3.53(H-2)与δH0.82(1β-CH3)、3.78(6-OH)具有NOE关系位于同侧，并且3.78(6-OH)与0.90(5-CH3)、δH3.53(H-2)具有NOE相关，由此可判断H-2/1β-CH3/5-CH3/6-OH空间取向一致为β；同时δH4.14(5-OH)与δH1.04(1α-CH3)具有NOE关系提示5-OH/1α-CH3位于一侧为α。由此可以判断化合物1的相对构型。根据以上解析，确定化合物1的结构。经查阅scifinder未见相关报道，确定为新化合物并将其命名为sec-hydroxyaeginetic acid-2-O-β-D-glucopyranoside，其碳氢数据归属见表1。化合物1的详细结构鉴定数据原始图谱可从本刊官网免费下载(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR数据Table 1 1H and 13C NMR spectroscopic data of compound 1

化合物2无定型粉末； -76.5(c0.018，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z323.146 3 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：3.50(1H，d，J=9.8 Hz，H-2)，3.86(1H，m，H-3)，1.90(1H，t，H-4α)，1.81(1H，dd，J=13.0，4.8 Hz，H-4β)，6.68(1H，d，J=16.0 Hz，H-7)，6.40(1H，d，J=16.0 Hz，H-8)，5.80(1H，s，H-10)，2.30(3H，s，H-12)，1.12(3H，s，1α-CH3)，0.90(3H，s，1β-CH3)，1.07(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：45.6(C-1)，79.4(C-2)，69.3(C-3)，44.1(C-4)，77.1(C-5)，81.9(C-6)，139.3(C-7)，134.8(C-8)，153.7(C-9)，119.8(C-10)，170.6(C-11)，14.2(C-12)，18.9(1α-CH3)，23.3(1β-CH3)，26.9(5-CH3)。以上数据结合文献[22]，确定化合物为frehmaglutin A。

化合物3无色晶体； -32.1(c0.025，CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z249.146 4 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)，δ：1.17(1H，m，H-2a)，1.69(1H，m，H-2b)，1.89(1H，m，H-3a)，1.38(1H，m，H-3b)，1.47(1H，m，H-4a)，1.80(1H，m，H-4b)，7.42(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.32(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，δH2.30(3H，s，H-10)，1.24(3H，s，1α-CH3)，0.80(3H，s，1β-CH3)，1.06(3H，s，5-CH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)，δ：39.6(C-1)，37.3(C-2)，18.9(C-3)，36.6(C-4)，75.5(C-5)，80.6(C-6)，153.3(C-7)，131.8(C-8)，201.4(C-9)，δC27.4(C-10)，25.7(1α-CH3)，27.4(1β-CH3)，27.0(5-CH3)。以上数据结合文献[21]，确定化合物为dihydroxy-β-ionone。

2.1.2 酸水解

化合物1(1 mg)，加入1 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L)，加热回流3 h，所得水解液用乙酸乙酯萃取3次，将水层浓缩至干[23]。加少量乙醇溶解，经HPLC分析采用蒸发光散射检测器，色谱柱为CHIRALPAKAD-H(250 mm × 4.6 mm)，流动相为正己烷-乙醇-三氟乙酸(750∶250∶0.25)，流速0.5 mL/min。通过比较样品与D-葡萄糖标准品的保留时间，确定化合物1中葡萄糖的绝对构型为D-葡萄糖(tR=18.3 min，D-glucose)。

2.1.3 绝对构型的确定

化合物1的绝对构型通过与文献对比ECD图谱确定。在ECD谱中(见图3)，222 nm处有一个正的Cotton效应，265 nm处有一个负的Cotton效应，与sec-hydroxyaeginetic acid[21]的ECD图谱一致从而确定该化合物的绝对构型为2S，5R，6R。

图3 化合物1的ECD谱图Fig.3 ECD spectra of the compound 1

2.2 细胞毒活性

本实验测试了从九蒸九晒熟地黄中分离得到的三个紫罗兰酮类化合物的细胞毒活性，结果显示，化合物1～3在25 μM浓度下能显著性降低人恶性黑色素瘤A375细胞的细胞活力，提示其可能具有抗人恶性黑色素瘤A375细胞的活性(如表3所示)。

表3 化合物1～3对A375细胞活力的影响Table 3 Cytotoxic activity of compounds 1-3 on A375 cells

3 结论与讨论

地黄为玄参科地黄属植物地黄的新鲜或干燥块根，经炮制加工以鲜地黄，生地黄以及熟地黄三种饮片形式应用于临床。地黄在炮制加工过程中，其药性药效均发生了改变，这种改变可能与其内在化学成分的改变密切相关。有研究表明[24]，炮制加工过程中熟地黄5-羟甲基糠醛(5-HMF)的含量显著高于生地黄，Zou等[25]利用一测多评法同时测定熟地黄中4种苯乙醇苷研究，结果表明地黄经炮制加工后4种苯乙醇苷成分含量均有所下降。Li等[26]研究表明，生地黄中的地黄苷A和地黄苷D的含量均比熟地黄中含量高。Jia等[14]对鲜地黄，生地黄和熟地黄中水苏糖在炮制过程中的变化研究，结果表明鲜地黄中水苏糖含量最高，其次是生地黄，熟地黄中含量最低。Zhang等[27]采用HPLC建立了同时测定了生地黄和熟地黄中5个苷类成分含量的方法，为开展生地黄、不同炮制方法制备熟地黄的药效物质基础研究提供了参考。为补充和完善熟地黄的化学成分，寻找地黄在炮制过程中的差异性成分，开展熟地黄相关化学成分研究是非常有必要的。本实验建立在前期研究的基础上，对九蒸九晒熟地黄进行进一步的化学成分分离纯化研究，分离得到3个紫罗兰酮类化合物。并对其进行了A375细胞毒活性的初步筛选评价研究。研究结果表明化合物1～3均能显著的抑制A375细胞活力，具有潜在的抗人黑色素瘤细胞的作用。本实验为熟地黄中紫罗兰酮类化合物对人黑色素瘤细胞细胞毒活性的相关机制研究提供参考价值，也为熟地黄药材的进一步开发利用提供科学依据。