UPLC-Q-TOF-MS/MS分析凉粉草多酚组分的化学成分

黄家晋，黄智霖，陈鸿庚，刘 坤，王立抗，郅 慧，丁利君，郑俊霞*

1广东工业大学轻工化工学院；2广东工业大学生物医药学院；3广州中医药大学中药学院，广州 510006

凉粉草(MesonachinensisBenth.)，是唇形科凉粉草属草本植物，分布在印度东北部，东南亚和中国台湾、福建、广东、广西和云南。凉粉草作为一种中药材，被誉为“仙草”，具有收敛、甘甜、清寒、清热、凉血、解毒的功效[1]，并且已经被开发为食品、天然保健品甚至是临床药品。现有研究证明，它的根、茎、叶及花各个组织含有大量的生物活性物质，包括多糖、黄酮、萜类、维生素和酚类[2]，具有很高的营养和医药保健价值。

酚类化合物对植物的生长起着重要的作用，对人体的各个器官也有十分强的保护作用。据报道，有学者通过研究发现凉粉草含有降血糖和高血压物质，包括β-谷甾醇、豆甾醇、α-和β-淀粉蛋白、齐墩果酸、马兜铃酸和β-谷甾醇糖苷[3]。同时，也有学者从凉粉草的水提液中鉴定出山奈酚、芹菜素、咖啡酸、原儿茶酸、丁香酸、香草酸、对羟基苯甲酸、齐墩果酸和熊果酸九种活性化合物[4]，其中咖啡酸、原儿茶酸、山奈酚等被认为是凉粉草抗氧化活性的重要组成部分，包括降低LDL氧化和炎症，从而提供预防心血管疾病的保护。

超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)技术，具有灵敏度高、分辨率高、分离效率高、分析时间短等优点[5]，同时还能得到化合物的分子量、元素组成以及离子碎片等信息，可快速确定化合物的结构，在药物分析领域得到越来越广泛的应用。目前尚不完全了解凉粉草多酚的成分，本实验采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对凉粉草中的化学成分进行快速、全面地定性分析，为凉粉草酚类化学成分的研究提供重要参考。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料

凉粉草样品于2019年6月采自福建省龙岩市，经暨南大学张英副教授鉴定为凉粉草(MesonachinensisBenth.)。

1.2 主要试剂

乙腈(色谱纯)购自美国Sigma公司、甲酸(色谱纯)购自美国Sigma公司、甲醇(色谱纯)瑞典Oceanpak公司；单体对照品：caffeic acid、quercetin-3-O-rutinoside、isoquercetin、quercetin和kaempferol国药集团化学试剂有限公司(纯度≥98.0%)；AB-8大孔树脂购自东鸿化工有限公司；纯水为Milli-Q系统纯化水。其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱联用仪(Nexera UHPLC LC-30A+AB SCIEX Triple TOFTM5600+)；PHS-3B雷磁pH计(上海精密科学仪器有限公司)；ML-104电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Milli-Q Advantage A10纯水系统；普通层析柱(40 mm×60 cm)。

2 方法

2.1 凉粉草多酚提取

将凉粉草全草进行清洗后，在阴凉通风处风干，切碎，干燥保存。准确称重凉粉草60 g，用1.5 L去离子水在微沸状态下提取3次，每次2 h[6]。参照Li等[7]和Bai等[8]纯化方法，略有改动，采用AB-8大孔树脂进行纯化，按质量比1/40(样品/填料)进行上样，先用去离子水洗至洗脱液无多糖和蛋白质等杂质，再用75%乙醇进行多酚化合物的洗脱，将洗脱液富集、浓缩和冷冻干燥得多酚提取物。

2.2 供试品和对照品溶液的制备

将凉粉草多酚提取物和对照品用甲醇充分溶解，稀释至50 μg/mL，过0.22 μm有机微孔滤膜即得，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析条件

2.3.1 色谱条件

色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流速为0.3 mL/min。柱温为40 ℃，进样量为3 μL。洗脱液为A，0.1%的甲酸乙腈溶液和B，0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱条件：0.01～1 min，5%→10%A；1～5 min，10%→30%A；5～8 min，30%A；8～9 min，30%→50%A；9～12 min，50%→60%A；12～20 min，60%→80%A；20～21 min，80%→90%A；21～22 min，90%→95%A[9]。

2.3.2 质谱条件

以负ESI模式运行，并配备DuoSprayTM离子源(AB Sciex，加利福尼亚州福斯特城)。 MS-MS检测器的条件如下：离子喷雾电压为-4.5 kV；离子源加热器，40 ℃；帘气，35 psi；雾化气体(GS1)，55 psi；TIS气体(GS2)，55 psi；碰撞能量(CE)，35 eV；碰撞能量扩散(CES)，15 eV。质量范围设置为m/z100～2 000[9]。采用Peak View分析软件和Scifinder网络数据库进行检索和分析。

3 结果与讨论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术测定凉粉草总酚提取物成分的保留时间、前体离子、MS/MS产物离子。凉粉草多酚样品在负离子模式下的总离子电流色谱图如图1所示，共鉴定出51个化合物，包括8个苯丙酸、3个苯丙酸二聚体、4个苯丙酸三聚体、1个苯丙酸四聚体、17个黄酮类、7个酚酸类、3个萜类和8个其它化合物。相关化合物质谱信息和结构见表1和图2。

图1 凉粉草多酚负离子模式下的总离子流图Fig.1 The total ion chromatograms of polyphenols from M.chinensis in negative ion modes

图2 凉粉草多酚化合物的结构Fig.2 Structures of polyphenols from M.chinensis

表1 凉粉草 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析结果Table 1 UPLC-Q-TOF-MS/MS analysis results of Meisona chinensis

续表1(Continued Tab.1)

续表1(Continued Tab.1)

3.1 苯丙酸

在凉粉草多酚样品中，化合物3、6、7、9、18、42、45和51属于苯丙酸类化合物，分别是丹参素[10]、咖啡酰己糖苷[11]、6,7-二羟基香豆素[11]、咖啡酸、丁香酚[12]、7-羟基香豆素[13]、oleoeuropein aglycone[14]和阿魏酸葡萄糖苷[15]。以咖啡酸和咖啡酰己糖苷为例，二者质谱裂解途径见图3。咖啡酰己糖苷母离子[M-H]-为m/z341.087 1，再失去一个己糖得到碎片m/z179.034 3，这是咖啡酸的母离子。咖啡酸进一步裂解，丢失一个羟基得到m/z161.033 3，m/z135.044 9则是裂解一个羧基后得到的离子碎片[11]。

图3 咖啡酸和咖啡酰己糖苷的质谱裂解途径图Fig.3 Fragmentation pathways of caffeic acid and caffeoyl hexoside

3.2 苯丙酸二聚体

以异迷迭香酸苷[15]和迷迭香酸[15]为苯丙酸二聚体的裂解例子，裂解情况见图4，异迷迭香酸苷在二级离子碎片中存在m/z179.034 3，表现为异迷迭香酸苷脱去一个己糖，得到迷迭香酸(m/z359.077 0)。迷迭香酸进一步裂解，得到离子峰为m/z197.045 5的丹参素碎片和m/z161.023 9的碎片，再丢失一个羰基得到离子碎片m/z135.044 6[15]。同时，化合物27初步鉴定为丹酚酸F[16]。

图4 迷迭香酸己糖苷和迷迭香酸的质谱裂解途径图Fig.4 Fragmentation pathways of rosmarinic acid-O-hexoside and rosmarinic acid

3.3 苯丙酸三聚体

4个三聚体在凉粉草多酚样品中被鉴定，分别是紫草酸[17]、丹酚酸H[18]、丹酚酸A[19]和丹酚酸C[11]。丹酚酸C的裂解规律如图5，[M-H]-为m/z491.174 2，类似迷迭香酸，在丹参素分子处发生裂解得到m/z179.032 7和311.054 3，进一步裂解羧基得到m/z135.045 6和179.032 7。同时，因碰撞碎裂产生的子离子还有m/z293.044 0和265.049 5[11]。

图5 丹酚酸C的质谱裂解途径图Fig.5 Fragmentation pathways of salvianolic acid C

3.4 苯丙酸四聚体

化合物26的母离子[M-H]-为m/z717.145 3，分子式C36H30O16，MS/MS离子产物有m/z519.093 0、339.049 5、321.039 4和179.032 0等，初步鉴定为丹酚酸B[17]，质谱裂解途径见图6。

图6 丹酚酸B的质谱裂解途径图Fig.6 Fragmentation pathways of salvianolic acid C

3.5 黄酮

一共有4个黄酮类化合物被鉴定。化合物10通过二级离子碎片m/z503.116 5、473.107 8和297.078 8，初步鉴定为apigenin-6,8-di-C-hexoside[20]。化合物11、39和47分别被鉴定为nobiletin、scutellarein和isoscutellarein-8-methyl ether。

12个黄酮醇类化合物在凉粉草多酚中被鉴定。化合物13、15、20、21、34和35都有槲皮素的二级特征离子m/z301，部分还有m/z295或者255，是槲皮素和它的衍生物，分别被鉴定为槲皮素戊聚糖[13]、芦丁、槲皮黄苷[22]、quercetin-3-O-hexoside[23]、异槲皮素和槲皮素。化合物16、24、25、40和44中，几乎都有m/z285、255和239的特征离子，初步鉴定为aromadendrin-3-O-rutinoside[12]、isomer of kaempferol-3-O-glucoside[24]、紫云英苷[24]、山奈酚和kaempferol-7-O-glucoside[28]。化合物33的母离子[M-H]-为m/z579.315 6，母离子丢失一个葡萄糖得到m/z399.254 0，初步鉴定为nobiletin-3-O-β-D-glucoside。

1个二氢黄酮类被鉴定。化合物29的母离子[M-H]-为m/z287.149 7，二级碎片m/z269.141 1、259.061 0、227.129 1和125.021 1，初步鉴定为红花素[25]。

3.6 酚酸类

一共有7个酚酸类化合物被鉴定。化合物1丢失一个羧基，生成一个特征离子m/z123.045 6，同时拥有特征离子m/z149.025 9、137.025 7、121.030 1和108.022 5，初步鉴定为香草酸[29]。化合物2的母离子[M-H]-为m/z197.045 8，分子式为C9H10O5，母离子丢失一个羧基得到m/z153.900 7，再失去一个甲氧基得到m/z123.046 2，初步鉴定为丁香酸[30]。化合物4和5都拥有的特征离子m/z119，是丢失一个羟基得到的离子，分别被鉴定为原儿茶醛[22]和对苯酚甲酸[31]。化合物8分子式为C8H8O3，失去一个甲氧基得到离子m/z121.004 2，初步鉴定为香草醛[21]。化合物14被鉴定为对羟基苯甲醛21]。母离子[M-H]-为m/z359.076 4的化合物30，失去一个葡萄糖得到m/z197.045 1，再失去一个羧基得到m/z137.032 5，初步鉴定为丁香酸葡萄糖苷[15]。

3.7 萜类

化合物17、38和50分别被鉴定为20-去氧鼠尾草酚[16]、3-O-D-glucopyranosyl platycodigenin methyl ester[32]和marstenacigenin A[32]，相关液质数据和结构式见表1和图2。

3.8 其它

化合物12、31、36、41、43、46、48和49分别被鉴定为tuberonic acid glucoside[23]、壬二酸[26]、(E)-10,10-dihydroxy-2-decenoic acid[33]、homoisocitric acid[34]、hydroxy octadecanedioic acid[35]、蓖麻油酸[32]、α-亚麻酸[36]和(E,E)-9-oxooctadeca-10,12-dienoic acid[26]，相关液质数据和结构式见表1和图2。

4 结论

本研究建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对凉粉草多酚组分进行分析的方法，通过分析质谱原始数据，包括：相对分子质量、保留时间、元素组成、碎片离子等信息，结合对照品、数据库和文献报道分析鉴定，鉴定并推测出51个化合物，证实了凉粉草多酚组分主要为黄酮类和苯丙酸及其多聚体组成，其中咖啡酰己糖苷、丹酚酸F、丹酚酸H、apigenin-6,8-di-C-hexoside、川陈皮素、nobiletin-3-O-β-D-glucoside、20-去氧鼠尾草酚、3-O-D-glucopyranosyl platycodigenin methyl ester、marstenacigenin A尚未在凉粉草相关文献中被报道，本研究认为该9个化合物在凉粉草中首次被发现。研究结果为凉粉草药效物质基础研究及开发利用奠定基础，对进一步开发新药具有重要的指导意义。