电活性生物膜通过调控巨噬细胞极化促进骨再生修复的体外研究

朱培君 赖春花 程鸣威 何逸恒 徐淑兰

南方医科大学口腔医院种植中心（广州510300）

口腔种植是牙颌系统重建的首选修复方案［1］。种植术区充足的骨量是实现骨整合的必要条件［2］，而炎症、外伤等原因造成的牙列缺损常伴骨组织缺损。临床上常应用引导骨组织再生术（guided bone regeneration，GBR）修复骨缺损，该术式创伤小且操作方便，规避了植骨手术高并发症的风险［3］。然而，临床常用的GBR 屏障膜缺乏成骨诱导性能，对于严重骨缺损的修复效果不佳，具备成骨诱导性能的屏障膜是解决GBR 术弊端的核心［4］。关于材料成骨诱导性能的研发，目前的研究热点集中于生物材料调控骨缺损区的免疫环境向有利于骨再生的方向发展，招募更多的骨原细胞，并促进骨矿化及重建［5］。此理念源自于骨免疫学说，生物材料植入机体后，将不可避免地引发免疫反应，巨噬细胞作为首先接触生物材料的免疫细胞之一，在生物材料植入后将转换为M1 促炎分型以行使“清道夫”的功能，而M2 抗炎型巨噬细胞分泌的抗炎因子和成骨因子在后期的骨愈合过程中发挥至关重要的作用［6-8］。巨噬细胞M1/M2 表型的转换决定了骨缺损修复生物材料周围的炎症程度及其骨修复效果，所以利用具备免疫调节性能的生物材料调节巨噬细胞M2 极化，营造有利于成骨分化的免疫环境，进而促进骨组织再生的研究思路是生物材料研发的创新导向，学者们将此性能称之为生物材料的骨免疫调节性能［9-10］。

研究表明，表面电荷可以调控巨噬细胞M2 极化［11］、减低巨噬细炎症反应而应用于肾脏再灌注损伤的治疗［12］，基于表面电荷对巨噬细胞的调控作用，本课题以研发一种能够调控巨噬细胞M2 极化的屏障膜为目的，已知P（VDF⁃TrFE）膜是一种适用于组织再生的电活性材料，利用其高压极化后表面带电的铁电性能［13］，本研究制备带电的P（VDF⁃TrFE）膜，以不带电的P（VDF⁃TrFE）膜为对照组，明确带电P（VDF⁃TrFE）膜对巨噬细胞M2 极化的影响，并构建多细胞共培养体系，进一步探究带电P（VDF⁃TrFE）膜介导的巨噬细胞环境下，BM⁃SCs 的成骨活性改变。为骨免疫调节性的新型生物材料的临床应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 带电P（VDF⁃TrFE）膜的制备及材料学表征P（VDF⁃TrFE）聚合物粉末溶于N，N⁃二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，搅拌至粉末完全溶解。溶液在钛片成膜后放置于马弗炉中，升温后退火结晶，冷却至室温，即获得P（VDF⁃TrFE）薄膜。将P（VDF⁃TrFE）膜放置于铜槽中，浸在二甲基硅油中，采用油浴极化的方法，在6 kV/cm、120 ℃条件下极化1 h，清洗、干燥备用。实验分组：P（VDF⁃TrFE）膜经高压极化后可形成带电表面，分为带电P（VDF⁃TrFE）膜（charged P（VDF⁃TrFE）membrane，CF）和不带电P（VDF⁃TrFE）膜（uncharged P（VDF⁃TrFE）membrane，UF）两组。

采用扫描电子显微镜观察并分析P（VDF⁃TrFE）膜的表面形貌和微观尺寸；采用准静态D33 测量仪检测P（VDF⁃TrFE）膜的压电常数D33。采用Zeta电位检测仪测量P（VDF⁃TrFE）膜的表面电势。

1.2 P（VDF⁃TrFE）膜上的巨噬细胞的M2表型检测

1.2.1 细胞培养与分组将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7（来源：ATCC 细胞库）培养于10%胎牛血清（FBS）和1%青/链霉素的高糖DMEM培养基，并置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。细胞融合至80%，胰蛋白酶消化，在P（VDF⁃TrFE）膜上以5×104个细胞/cm2的密度进行细胞接种，分组同材料分组。

1.2.2 细胞增殖无菌消毒处理后的P（VDF⁃TrFE）膜置于12孔板中，将巨噬细胞接种至P（VDF⁃TrFE）膜表面，3、5 d 后终止培养，将P（VDF⁃TrFE）膜用无菌镊子取出放置于新的12 孔板中，PBS 漂洗，加入含10%细胞数量检测试剂盒⁃8（cell counting kit⁃8，CCK⁃8）试剂，孵育2 h，取上清液于96 孔板中，采用酶标仪测量450 nm 波长下的吸光度。

1.2.3 细胞形态检测将巨噬细胞接种至P（VDF⁃TrFE）膜表面，在培养3、5 d后，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，洗涤，透化。加入染料4，6⁃联脒⁃2⁃苯基吲哚及荧光素异硫氰酸酯，对细胞核及骨架进行染色。避光孵育40 min 后，将膜转至载玻片上，封片，观察并采集图像。

1.2.4 流式细胞术检测巨噬细胞的M2 极化分型将细胞细胞接种至P（VDF⁃TrFE）膜表面，培养3、5 d 后，重悬洗涤，以每流式管1 × 106个细胞为标准，100 μL 含0.1%BSA 的PBS 重悬；向各管细胞中依次加入2 μL PE 标记的小鼠CD206（M2型巨噬细胞表面标记物）抗体，采用Cytoflex 流式细胞仪检测阳性细胞。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT⁃PCR）检测M2表型相关基因将细胞接种至P（VDF⁃TrFE）膜表面，培养3、5 d 后提取RNA 并逆转录，采用荧光定量PCR 仪进行cDNA 扩增，检测M2 型巨噬细胞的相关基因精氨酸酶⁃1（arginase⁃1，Arg⁃1）、白介素⁃10（interleukin⁃10，IL⁃10）的mRNA 表达水平（引物序列见表1）。采用相对定量法分析结果。

表1 qRT⁃PCR 引物Tab.1 Primers for qRT⁃PCR

1.3 条件培养基诱导对rBMSCs的成骨活性的影响

1.3.1 条件培养基的配制为了构建P（VDF⁃TrFE）膜、巨噬细胞、BMSCs的间接共培养体系，将巨噬细胞按上述方式接种于P（VDF⁃TrFE）膜上，收集培养体系的上清液，1 000 r/min、4 ℃离心5 min，弃沉淀，上清液与DMEM/F12 完全培养基以1∶1 的比例混合配制，即获得P（VDF⁃TrFE）膜⁃巨噬细胞条件培养基（conditioned medium，CM），-80 ℃保存待用。

1.3.2 rBMSCs 的培养将rBMSCs（来源：ATCC细胞库）培养于含10%胎牛血清、1%青/链霉素的DMEM/F12 完全培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。取3 ～6 代的rBMSCs 以1 × 105的细胞密度接种于六孔板中，待细胞稳定后，将完全培养基替换为P（VDF⁃TrFE）膜⁃巨噬细胞条件培养基，根据材料分组，分为带电P（VDF⁃TrFE）膜（CF）和不带电P（VDF⁃TrFE）膜（UF）两组。

1.3.3 ALP 染色条件培养基刺激诱导rBMSCs的第7 天，终止培养，PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定后洗涤，加入染色剂，摇床上孵育1 h，双蒸水终止染色后，显微镜观察并拍照。

1.3.4 茜素红定性染色及定量检测条件培养基诱导刺激rBMSCs 的第14 天，终止培养，双蒸水洗涤后固定细胞，加入茜素红染色剂，摇床上孵育30 min，洗涤，显微镜观察并拍照，最后于六孔板中加入1 mL 的10%十六烷基吡啶溶液/孔，酶标仪检测562 nm 波长下的吸光度。

1.4 统计学方法实验所得数据使用SPSS 20.0记录并分析，正态分布资料用均数±标准差表示，采用两独立样本t检验进行数据分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P（VDF⁃TrFE）膜的材料学检测表面形貌结果（图1A）显示本实验所制备的P（VDF⁃TrFE）膜表面均匀且致密，存在少量微孔隙，两组表面形貌无明显差异；为了表征材料的电学性能，检测P（VDF⁃TrFE）膜的压电常数D33，带电、不带电P（VDF⁃TrFE）膜压电常数D33 分别为（-10 ±0.06）pC/N、（0±0.02）pC/N；Zeta 电位检测表征材料表面电荷，结果见图1B。

图1 不带电、带电P（VDF⁃TrFE）膜的材料表征Fig.1 Characterization of uncharged and charged P（VDF⁃TrFE）membrane

2.2 P（VDF⁃TrFE）膜上巨噬细胞的行为改变

2.2.1 细胞增殖P（VDF⁃TrFE）膜上巨噬细胞的CCK⁃8 检测结果见图2A，培养第3 天，带电、不带电P（VDF⁃TrFE）膜的细胞数量差异无统计学意义，而到培养的第5 天，带电P（VDF⁃TrFE）膜组的巨噬细胞增殖情况优于不带电组（P＜0.05）。

2.2.2 细胞形态图2B 为巨噬细胞在带电、不带电P（VDF⁃TrFE）膜上的形态图，巨噬细胞在刺激培养的第3 天，在P（VDF⁃TrFE）膜上表现为圆形的正常形态，带电膜表面的巨噬细胞偶见伸长的形态；在细胞培养的第5 天，不带电膜表面的细胞仍保持圆形形态，而带电P（VDF⁃TrFE）膜上的细胞胞体向两级伸长。

2.2.3 巨噬细胞的M2 极化分型巨噬细胞在不带电、带电P（VDF⁃TrFE）膜上的M2 表型检测结果如图3A，图中阴性对照组（negative control）是未加入抗体的细胞空白对照组，培养第3 天，CD206 阳性细胞率分别为2.28%和2.31%。培养第5 天，相比于不带电P（VDF⁃TrFE）膜（2.4%），带电P（VDF⁃TrFE）膜上的M2 型巨噬细胞（32.7%）占多数。

2.2.4 巨噬细胞M2表型相关基因的表达水平巨噬细胞在P（VDF⁃TrFE）膜上的基因表达检测结果（图3B）显示，P（VDF⁃TrFE）膜刺激巨噬细胞第3 天后，两组基因表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。在培养的第5 天，相比于不带电膜，带电P（VDF⁃TrFE）膜上的巨噬细胞较高地表达Arg⁃1、IL⁃10 等M2 表型相关基因（P＜0.05）。

2.3 条件培养基诱导对rBMSCs 成骨活性的影响

图2 巨噬细胞在不带电、带电P（VDF⁃TrFE）膜上的行为改变Fig.2 Behavioral changes of macrophage on uncharged and charged P（VDF⁃TrFE）membrane

2.3.1 ALP染色分别用带电、不带电P（VDF⁃TrFE）膜⁃巨噬细胞条件培养基诱导rBMSCs，7 d 后ALP染色的结果如图4A，相比于不带电组组，带电P（VDF⁃TrFE）膜条件培养基诱导下的rBMSCs 周围可见更多的蓝染物质，颜色较对照组深。

2.3.2 茜素红染色及定量分析结果结果如图4B，相比于不带电组，带电组条件培养基诱导的rBMSCs 周围可见大量红褐色结节，结节体积较大且分布广泛，茜素红染色的半定量检测结果与染色结果一致（P＜0.05）。

3 讨论

口腔颌面部的大面积骨缺损严重影响患者的语音、吞咽及咀嚼功能，成为口腔颌面临床修复亟待解决的难题［14］。引导骨组织再生术作为临床上最有效的骨增量方式之一，即是采用具备物理屏障作用的屏障膜覆盖于骨缺损区上，阻挡软组织细胞长入缺损区产生竞争性抑制，为骨缺损区的修复再生创造稳定而无干扰的空间［15］。由于大面积骨缺损缺乏自愈的潜力，临床上对修复此类骨缺损的屏障膜提出更高的要求，即在发挥物理屏障作用的同时，兼具促进骨再生的生物活性。为了研发新型骨缺损修复材料，并鉴于免疫细胞对骨再生的重要调控作用，学者们提出了生物材料通过改变免疫环境间接促进成骨的性能即骨免疫调节性能［16-17］，并阐明了机体的成骨活动是由多细胞、多系统共同参与的［18］，利用单细胞体外模型来验证生物材料的成骨效能的研究思路过于单一，生物材料通过介导免疫细胞行为变化调控成骨分化的思路才更符合体内成骨过程。

图3 不带电、带电P（VDF⁃TrFE）膜上巨噬细胞M2 极化表型检测Fig.3 The deteetion of M2 phenotype macrophage on uncharged and charged P（VDF⁃TrFE）membrane

图4 rBMSCs 成骨活性检测Fig.4 Detection of osteogenic activity of rBMSCs

巨噬细胞是生物材料植入机体内首先接触的免疫细胞［19］。大量体内外实验验证了巨噬细胞对骨再生的体内外调控作用［20-21］，生物材料诱导巨噬细胞M2 极化的功能在骨缺损修复过程中发挥着关键作用，M2 型巨噬细胞通过分泌抗炎因子IL⁃10、Arg⁃1 和成骨因子增强成骨活性［22］。诱导巨噬细胞M2 极化的生物材料设计理念被广泛应用于屏障膜、种植体表面处理等研究中［23-24］。其中巨噬细胞具备高度可塑性，表面电荷对巨噬细胞M2 极化发挥一定的调控作用［25］，本课题将表面电荷对巨噬细胞的调控作用引入屏障膜的设计研发中，制备携带表面电荷的P（VDF⁃TrFE）生物膜并检测其对巨噬细胞极化及后继成骨分化的影响。

本实验制备的膜材料具有均匀且致密的形貌，这符合临床屏障作用的要求，并且膜上的微观孔隙也是屏障膜传输营养的通道，CCK⁃8 检测结果也提示了带电P（VDF⁃TrFE）膜的良好生物相容性，可知带电P（VDF⁃TrFE）膜符合临床屏障膜的基本要求。压电常数D33 和Zeta 电位检测结果提示着带电P（VDF⁃TrFE）膜的成功制备。巨噬细胞在带电P（VDF⁃TrFE）膜刺激下，细胞胞体向两级伸长，此形态与其M2 极化相关［26］。流式、PCR 结果表明了带电P（VDF⁃TrFE）膜能有效促进巨噬细胞的M2 极化，增加抗炎IL⁃10 基因的表达。利用上清液制取条件培养基的间接共培养模型被广泛应用于生物材料骨免疫调节性能的研究中［16］，本实验条件培养基诱导刺激rBMSCs 的实验结果中，ALP 和茜素红染色分别提示着带电膜⁃巨噬细胞条件培养基能有效增加rBMSCs 的早期和晚期成骨活性，阐明了带电P（VDF⁃TrFE）膜通过调控巨噬细胞极化促进BMSCs 成骨分化的作用。

本实验以研发促进成骨分化的屏障膜为目的，考虑到生物材料植入后的多细胞参与体系及免疫细胞在成骨活动中的重要作用，以研究电活性生物膜的骨免疫调节性能为导向，构建膜、巨噬细胞、BMSCs 的共培养体系，成功验证了带电P（VDF⁃TrFE）膜对巨噬细胞M2极化的促进作用，提示了带电P（VDF⁃TrFE）膜介导的M2 极化对BMSC成骨分化的积极影响，这对于兼具免疫调节性能及促成骨性能生物材料的研发具有指导性意义，为屏障膜的优化设计提供创新性思路。