非编码RNA对骨髓间充质干细胞成骨分化影响研究进展

梁文强，张怀斌，杨国清，杨杜斌，谢犇，王勇平, *

（1兰州大学第一临床医学院骨科；2兰州大学第一医院骨科，兰州 730000）

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一种多能干细胞，能够分化发育为不同组织，且来源广泛，因此被视为骨组织工程良好的种子细胞[1]。骨折修复、骨缺损与骨不连、骨质疏松等骨科常见疾病可以通过骨髓间充质干细胞的多向分化能力寻求更加可靠的治疗方案[2]。骨髓间充质干细胞的分化过程受到多种因素的作用，近年的研究发现，非编码RNA对骨髓间充质干细胞成骨分化过程具有一定的作用。微小RNA（microRNA,miRNA）是一中高度保守的非编码RNA，参与多种生理过程，如正常细胞的发育、增殖、分化和凋亡，以及维持细胞的多能性[3]。长链非编码RNA（longchain noncoding RNA, lncRNA）是一类长度超过200 nt 的RNA 分子，本身并不编码蛋白，但近年的研究发现，lncRNA参与细胞的增殖、分化及凋亡过程[4]。miRNA与lncRNA对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响逐渐受到研究人员的重视，因此对两者在骨髓间充质干细胞成骨分化中的研究进展进行综述，为骨组织工程和临床治疗提供了新的理论和实验依据。

1 BMSCs向成骨分化

BMSCs是来源于中胚层的多能干细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，甚至成肌细胞，因此被认为是多潜能细胞。更重要的是，BMSCs可以从成人组织中提取间充质干细胞，包括骨髓、脐带血、脂肪组织和牙齿组织[5-7]，由于BMSCs取材来源广泛并且具有多向分化、自我更新、免疫调节等功能，已成为基因治疗、组织工程、细胞替代治疗和再生医学中种子细胞的重要来源。

成骨细胞可以促进钙盐在骨基质中的沉积，从而促进骨的重建。此外，矮小相关转录因子2（runt-related transcription factor 2, RUNX2)、碱 性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和骨桥蛋白（osteopontin, OPN）可用于检测BMSCs的成骨分化程度[8]。近年来，骨再生和骨形成已成为骨组织学研究的重要方向。其中，成骨细胞在骨再生和骨形成中起着重要作用，因此，研究骨髓间充质干细胞的成骨分化在骨组织工程中非常重要。BMSCs成骨分化受多种信号通路的影响，其中最为经典的信号通路是Wnt 信号通路，BMP-Smads信号通路也是参与调控BMSCs向成骨细胞分化及骨形成的关键信号通路之一。Notch信号通路具有促进成骨与抑制成骨的双向作用，HIPPO-YAP/TAZ通路通过与其他信号通路之间的级联反应调控BMSCs的增殖及成骨分化，MAPK信号通路通过上调Runx2的表达[5]，促进BMSCs成骨向分化过程[4]。

2 miRNA对BMSCs成骨分化的影响

许多研究表明，miRNAs在骨髓间充质干细胞成骨分化中起重要作用。Dicer是miRNA合成所必需的内切酶，Oskowitz等人敲除小鼠核酸内切酶Dicer后，发现小鼠的骨髓间充质干细胞失去了成骨分化的能力，从而证明miRNA与骨的形成和发育密切相关[9]。miRNA在成骨分化过程中扮演不同的角色，既可以促进BMSCs成骨分化，也有许多miRNA抑制BMSCs的成骨分化。

2.1 miRNA对BMSCs成骨分化的促进作用不少miRNA具有促进成骨分化的作用，例如，miR-92b-5p、miR-187-5p、miRNA-27a、miRNA-130a、miRNA-27b、miRNA-128-3p、miRNA-199a、miR-378a-3p、miR-21和miR-26a等都能促进BMSCs的成骨分化（表1）。

Yuan等[10]通过研究褪黑激素对BMSCs成骨分化的作用发现，褪黑素可上调miR-92b-5p的表达，并且miRNA-92b-5p通过直接靶向细胞内粘附分子-1（ICAM-1）参与BMSCs向成骨细胞分化。miRNA-187-5p同样直接靶向作用于ICAM-1从而促进BMSCs向成骨细胞分化[11]。Gu等[12]的研究结果显示，miRNA-27a上调能够促进大鼠BMSCs成骨分化并且抑制成脂分化，并且发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptors γ, PPARγ）和 骨形态形成蛋白拮抗蛋白1（gremlin1, GREM1）是miRNA-27a的直接作用靶点，为激素相关性骨坏死的治疗提供了新的思路。Lin 等人[13]发现miRNA-130a和miRNA-27b靶向结合PPARγ，促进RUNX2和Osterix的基因表达，最终促使BMSCs向成骨细胞分化。

Lin[14]等人通过对Wnt3α信号通路促进BMSCs成骨分化的研究发现，miRNA-128-3p可显著降低糖皮质激素对骨R-羟基谷氨酸蛋白（bone gamma-carboxyglutamate protein, BGLAP）、RUNX2 、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2, BMP-2）的抑制作用，表明miRNA-128-3p具有促进BMSCs成骨分化的能力，同时miRNA-128-3p正向调控Wnt3α信号通路并提升成骨分化过程中ALP的活性。对于长期使用糖皮质激素的病人而言，药物性骨质疏松的情况不容忽视。miRNA-199a过表达后能够逆转糖皮质激素对BMSCs成骨分化的抑制作用，miRNA-199a通过直接抑制Klotho蛋白和信使RNA表达促进BMSCs的成骨分化，影响FGFR1/ERK 和JAK1/STAT1信号通路[15]。Yu等人[16]的研究发现，miRNA-378a-3p可促进老龄大鼠BMSCs成骨基因Runx2、ALP、Col I和骨钙素（osteocalcin, OCN）的表达水平和ALP活性，促进BMSCs向成骨细胞分化。Yan 等人[17]的实验表明，miRNA-21通过增加p-Akt和激活缺氧诱导因子‐1α，促进BMSCs在体外的迁移和成骨分化，并促进其成骨能力。由于RNA分子不稳定容易降解，因此借助介孔硅纳米颗粒的物理性质，将其作为载体将miRNA-26a转染细胞，结果表明载体在体外能保护miRNA-26a不被降解，并可显著促进rBMSCs的成骨分化[18]。

2.2 miRNA对BMSCs成骨分化的抑制作用

miRNA在BMSCs不仅可促进成骨分化，一些miRNA对成骨分化过程有抑制作用。通过对此类miRNA及其作用靶点的研究可以为骨质疏松、股骨头坏死等疾病提供新的治疗思路（表1）。

表1 miRNAs对BMSCs成骨分化的作用Tab. 1 The effect of miRNAs on osteogenic differentiation of BMSCs

Chen等[19]发现miRNA-17-3p在成骨过程中抑制矿化、ALP活性和成骨相关基因ALP、Col1A1和OPN的表达，在成骨细胞分化过程中直接调节Sox6的表达进而抑制成骨分化。糖尿病性骨质疏松症是由于BMSCs在高糖环境下生理功能异常所致，因此对于糖尿病性骨质疏松相关miRNAs的研究成为当下的热点之一。miRNA-365a-3p通过靶向RUNX2负向调节hBMSCs的成骨分化，从而促进骨质疏松的进展[20]。Wang等[21]通过研究发现，高糖环境抑制了BMSCs的成骨分化，而且miRNA-214-3p的表达明显上调，通过进一步实验发现，miRNA-214-3p通过靶向结合β‐catenin而发挥抑制BMSCs的成骨分化。Liu等[22]的实验发现，miRNA-337可直接靶向作用于Ras相关蛋白1A（Ras-related protein Rab-1A,Rap1A）从而抑制经过高糖处理的BMSCs向成骨细胞分化，这为临床上糖尿病性骨质疏松症患者提供了潜在的治疗方法。p53在骨形成过程中起负调控作用，p53诱导的miRNA-145a通过靶向作用核心结合因子β（Cbfb）抑制成骨分化，p53/miRNA-145a/Cbfb信号通路可能成为治疗骨质疏松的新靶点[23]。

Yang等[24]在对骨质疏松的研究中发现，叉头盒转录因子O1（forkhead box O1, FOXO1）在骨质疏松组织中的表达水平低于邻近非骨质疏松组织，并且在骨质疏松组织中，miRNA-1271-5p与FOXO1的表达呈负相关；miRNA-1271-5p过表达下调BMSCs中的FOXO1表达，抑制其成骨分化。miRNA-493-5p通过直接靶向结合E盒结合锌指蛋白2（zinc finger E‐box binding homeobox 2, ZEB2）使其水平降低，进一步使Wnt/b-catenin信号通路失活从而产生对BMSCs成骨分化的抑制作用[25]。

miRNA通过特定的靶点、信号通路促进成骨分化，对多条BMSCs成骨分化通路均有作用。有研究发现miRNA-19b-3p在BMSCs中过表达，并且靶向下调PTEN表达，促进Akt和mTOR的磷酸化，从而通过自噬抑制BMSCs的成骨分化[26]。Wang等[27]证明miRNA-765能够与Bmp6靶向结合，进而调控BMP6/Smad1/5/9信号通路来抑制hMSC的成骨分化。在对创伤性股骨头坏死患者的研究中发现，过表达的miRNA-93-5p通过靶向BMP-2抑制成骨分化，并且降低ALP、Runx-2等成骨相关基因的表达[28]。

3 lncRNA对BMSCs成骨分化的影响

lncRNA通过多条途径发挥其生物学功能。传统的机制包括与RNA结合蛋白（RNA binding proteins,RBP）和染色质修饰复合物结合、与miRNA竞争、调节启动子和与转录相互作用。

3.1 lncRNA对BMSCs成骨分化的促进作用

一些lncRNA对BMSCs成骨分化的作用通过miRNA实现。Li[29]等发现，lncRNA H19通过miR-532-3p/SIRT1信号通路介导雌激素促进BMSCs成骨分化。lncRNA Gas5过表达通过miRNA-498上调RUNX2的表达，促进BMSCs的成骨分化，并且lncRNA Gas5在骨质疏松患者中的表达较低[30]。Zhang等[31]同样发现骨质疏松患者血清中lncRNA XIXT表达明显下调，lncRNA XIXT通过miRNA-30a-5p上调RUNX2的表达，从而诱导BMSCs成骨分化。有研究揭示了lncRNA Xist/miR-19a-3p/Hoxa5通路在诱导BMSCs成骨分化中的关键作用[32]。这些研究为骨质疏松的靶向治疗提供新思路。

Chen等发现人骨髓间充质干细胞高表达lncRNA MCF2L-AS1，lncRNA MCF2L-AS1通过吞噬miR-33a正向调节Runx2的表达，促进BMSCs的成骨分化；lncRNA HotTip通过与WDR5相互作用，上调β‐catenin基因表达，从而激活Wnt/β‐catenin信号通路，促进成骨分化[33]。另有研究表明，lncRNA TNCOS-00023297不仅有促进BMSCs成骨分化的作用，还可以促进BMSCs分泌血管内皮因子同时具有抑制成指分化的作用[34]。

表2 lncRNA对BMSCs成骨分化的作用Tab. 2 The effect of lncRNA on the osteogenic differentiation of BMSCs

3.2 lncRNA对BMSCs成骨分化的抑制作用

近年的研究发现，一些lncRNA与骨质疏松的发生较为密切，对此类lncRNA的研究或许能为临床中骨质疏松的诊断与治疗提供新的方法与思路。Jiang等[35]通过小鼠建立骨质疏松的模型后探究lncRNA对成骨分化作用的影响，结果发现lncRNA SNHG1过表达增强发育下调蛋白4（neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4, Nedd4）与p-p38的相互作用，破坏p-p38的蛋白质稳定性，促进p-p38的泛素化，从而对P38信号通路产生负调控，最终抑制BMSCs的成骨分化。有研究发现骨质疏松症患者血清和BMSCs中 lncRNA HOTAIR水平明显高于正常人，进一步抑制HOTAIR诱导BMSCs后发现，ALP活性升高，成骨标志物基因增多，钙化结节增多，而HOTAIR过表达则表现出相反的作用，在对具体机制的研究中发现，lncRNA HOTAIR对BMSCs成骨分化的抑制作用是通过对Wnt/β‐catenin通路的负向调控产生的[36]。同样的Wang[37]的研究结果表明，在骨质疏松成骨分化过程中，lncRNA DANCR和miRNA-320a通过抑制Wnt/β‐catenin信号通路进行调控，对成骨分化有一定的抑制作用。

He等[38]研究发现，lncRNA ODIR1具有抑制BMSCs成骨分化的作用，ODIR1与F-box家族蛋白 成 员FBXO25 （F-box protein-25, FBXO25）相互作用，并通过募集CUL3促进FBXO25的蛋白酶体依赖性降解，FBXO25增加H2BK120的泛素化，其随后促进H3K4的三甲基化，H2BK120ub和H3K4me3均形成松散的染色质结构，诱导关键转录因子OSX的转录，由此推论出lncRNA ODIR1通过FBXO25/H2BK120ub/H3K4me3/OSX信号通路抑制BMSCs成骨分化。

4 小结

BMSCs是组织工程成骨种子细胞的重要来源，在骨缺损修复和再生领域具有良好的应用前景。miRNAs和lnc RNA在BMSCs成骨分化中起关键作用。随着研究的进展，针对miRNAs和lnc RNA靶基因的基因治疗将使患者受益。此外，随着生物医学的不断发展，BMSCs向成骨细胞分化的分子机制将日益清晰，从而为骨组织工程和临床治疗提供新的理论和实验依据。