视黄醇结合蛋白2基因沉默对卵巢癌SKOV3/PTX细胞迁移侵袭的影响

冯同富 陈德军 叶常鸿 汪黎明 金晶 雷燕 李力

1湖北省妇幼保健院妇科（武汉430070）；2广西医科大学区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（南宁530021）

卵巢癌由于发病隐蔽、易转移，成为致死率最高的妇科恶性肿瘤［1］。癌细胞的转移是一种涉及到多种分子机制的复杂生理病理过程。研究表明，视黄醇结合蛋白2（retinol⁃binding protein 2，RBP2）参与了多种恶性肿瘤的发生和进展过程［2-3］，但其和卵巢癌的侵袭转移是否存在关联，目前国内外还鲜有报道。因此，本研究选择更易发生转移的卵巢上皮癌耐药细胞SKOV3/PTX，通过小分子干扰RNA 技术抑制RBP2 的表达，探讨RBP2 基因沉默对卵巢癌上皮细胞迁移和侵袭能力的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及质粒卵巢癌SKOV3 细胞系及其紫杉醇（paclitaxel，PTX）耐药细胞系SKOV3/PTX 细胞由广西医科大学惠赠。

1.1.2 试剂及仪器RT⁃qPCR 试剂盒购自美国In⁃vitrogen 公司；蛋白印迹法（Western blot）检测试剂套装购自上海Beyotime 公司；Matrigel 生物胶购自美国BD 公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；GAPDH、β⁃actin 及RBP2 抗体购自英国Abcam公司；β⁃catenin、VEGF、及MMP⁃2 抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司，离心机购自德国Eppendorf 公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympas 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染所有细胞均用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的DMEM 培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。参照干扰效果最好的针对RBP2 基因的shRNA 和阴性对照shRNA⁃NC，建立重组慢病毒干扰载体，并转染SKOV3/PTX细胞，48 h后利用荧光显微镜观察转染效率，再使用嘌呤霉素筛选，获得稳定传染细胞株。实验分为三组，干扰组：感染沉默RBP2的慢病毒的SKOV3/PTX细胞（SKOV3/PTX⁃RBP2i）；阴性对照组：感染阴性对照慢病毒的SKOV3/PTX细胞（SKOV3/PTX⁃NC）；空白对照组：未感染的SKOV3/PTX 细胞（SKOV3/PTX）。

1.2.2 划痕实验检测细胞迁移能力取生长良好的、呈对数生长的三种细胞，调整细胞密度为6 ×105cell/mL 并接种于六孔板，每孔1 mL，常规培养过夜，待细胞密度达到90%左右，用枪头进行划痕，用PBS 洗细胞3 次，然后放入培养箱中常规培养，于0、24、48 h 拍照分析。

1.2.3 Transwell 侵袭实验检测细胞侵袭能力每组取3 × 105个细胞接种于transwell 小室表面，37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h 后用70%冰乙醇溶液固定细胞1 h；用0.5%结晶紫染液染色20 min，PBS 清洗后显微镜下观察拍照。计算侵袭细胞数。实验重复3 次。

1.2.4 RT⁃PCR 法检测细胞中的基因表达取对数生长期细胞进行胰酶消化，离心后收集细胞，Trizol 法提取总RNA 并逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，引物序列：β⁃catenin 上游：5′⁃CAAGTGG⁃GTGGTATAGAGG⁃3′，下游：5′⁃AGTCCATAGTGAA⁃GGCGAAC⁃3′；VEGF 上游：5′⁃ATCCAATCGAGACC⁃CTGGTG⁃3′，下游：5′⁃ATCTCTCCTATGTGCTGGCC⁃3′；MMP⁃2 上游：5′⁃ACCACAGCCAACTACGATGA⁃3′，下游：5′⁃GCTCCTGAATGCCCTTGATG⁃3′；内参GAPDH 上游5′⁃TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT⁃3′，下游5′⁃TTACTTCGTCCAACCACCGA⁃3′。扩增条件：50 ℃2 min，95 ℃10min；95 ℃30 s，60 ℃30 s，40 个循环，以GAPDH 为内参计算RBP2 的相对表达量，绘制溶解曲线，最终数据以2⁃△△Ct进行分析，实验重复3 次。

1.2.5 Western blot法检测细胞中的蛋白表达提取各组总蛋白并检测蛋白浓度。根据各组蛋白浓度上样，以90 V 电压进行SDS⁃PAGE 电泳，分离后转膜、封闭，1 h 后加入相应的一抗4 ℃孵育过夜。第2 天，将膜取出并以TBS 清洗3 次，加入二抗室温孵育2 h；然后，TBS 缓冲液洗涤3 次，最后放入TBST 中漂洗10 min。在凝胶成像系统利用超敏ECL 化学发光底物曝光显影，存储图片。以GAP⁃DH 作为内参照分析目的蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计量资料以表示，计量资料两组间比较采用t检验，两组以上的组间比较采用单因素方差分析法，组内两两多重比较采用SNK⁃q检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RBP2基因表达沉默的SKOV3/PTX细胞系的鉴定建立稳定干扰RBP2 表达的细胞株SKOV3/PTX⁃RBP2i 后采用Western blot 法进行鉴定，结果显示，转染重组载体后，SKOV3/PTX⁃RBP2i 细胞中RBP2 的蛋白表达水平明显低于SKOV3/PTX⁃NC 细胞及SKOV3/PTX 细胞，见图1。说明RBP2 基因表达沉默的SKOV3/PTX 细胞系构建成功。

图1 RBP2 基因表达沉默细胞系SKOV3/PTX⁃RBP2i 蛋白水平的鉴定Fig.1 The silence effect on protein level in SKOV3/PTX⁃RBP2i

2.2 划痕实验结果分析划痕实验结果分析提示，SKOV3/PTX⁃RBP2i 细胞、SKOV3/PTX⁃NC 细胞及SKOV3/PTX 细胞在24、48 h 的划痕愈合率分别为（37.74±3.61）%、（55.87±4.21）%；（75.24±3.16）%、（95.66±4.06）%；（72.38±2.83）%、（98.24±3.15）%，差异有统计学意义（F= 218.063，P＜0.01；F=198.173，P＜0.01），且沉默组均于阴性对照组及空白对照组（24 h：q= 25.031，P＜0.01；q= 26.090，P＜0.01，48 h：q= 23.382，P＜0.01；q= 25.274，P＜0.01），差异有统计学意义，但SKOV3/PTX⁃NC 细胞与SKOV3/PTX细胞之间，划痕的愈合率差异有统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.3 侵袭实验结果分析体外侵袭实验显示，沉默组、阴性对照组和空白对照组的穿膜细胞数量分别为（24.13±3.39），（63.32±3.81），（66.43±3.58），差异有统计学意义（F=128.842，P＜0.01）。其中，阴性对照组和空白对照组的穿膜细胞数明显高于沉默组，差异有统计学意义（q= 18.869，P＜0.01；q=20.366，P＜0.01），见图3。

图2 各组细胞的划痕愈合情况Fig.2 Healing ability of each groups

图3 各组细胞的侵袭情况Fig.3 Invasionability of each groups

2.4 β⁃catenin、VEGF 及MMP⁃2 在三组细胞中的表达情况RT⁃PCR 检测提示，沉默组、阴性对照组和空白对照组的β⁃catenin、VEGF 及MMP⁃2 的mRNA 表达水平差异有统计学意义（F= 10.443，P＜0.05；F=11.681，P＜0.01；F=30.645，P＜0.01），且上述三个指标在沉默组SKOV3/PTX⁃RBP2i 细胞中的表达水平均低于阴性对照组SKOV3/PTX⁃NC细胞和空白对照组SKOV3/PTX 细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；Western blot 法检测显示，沉默组、阴性对照组和空白对照组的β⁃catenin、VEGF及MMP⁃2 的蛋白表达水平差异也有统计学意义（F= 22.144，P＜0.01；F= 45.068，P＜0.01；F=16.579，P＜0.01），同样，三个指标在阴性对照组和空白对照组的表达水平均低于沉默组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 各组细胞中β⁃catenin、VEGF 及MMP⁃2 的表达Fig.4 Expression of β⁃catenin、VEGF and MMP⁃2 proteins in each groups

3 讨论

恶性肿瘤是威胁人类健康的严重疾病。局部浸润和远处转移是恶性肿瘤最主要的生物学特性，而且是导致患者死亡的主要原因［4］。卵巢癌作为常见的妇科恶性肿瘤之一，更易发生侵袭和转移，因此，其5年生存率仅为35%［5］。克服卵巢癌的侵袭性和转移性成为延长卵巢癌患者生存期的关键所在。RBP2 具有组蛋白去甲基化转移酶的活性，它广泛参与了肿瘤的发生［6］、分化［7］及转移［8］等生物学行为。目前，RBP2 在卵巢癌侵袭转移中的作用相对研究较少，探讨其在卵巢癌细胞侵袭转移过程中的作用和分子机理有着重要的研究意义。一般而言，卵巢癌耐药细胞较亲本细胞更容易发生侵袭和转移。因此，本研究在卵巢癌耐药细胞SKOV3/PTX 中敲低RBP2 的表达，发现RBP2 表达受到抑制后，卵巢癌细胞的迁移能力极大下降。侵袭实验也表明干扰RBP2 的表达可以显著降低SKOV3/PTX 细胞的侵袭转移能力，本研究初步证实RBP2 参与了卵巢癌细胞的侵袭和转移。

肿瘤的侵袭和转移过程及调控机制非常复杂，目前，已发现FAK/ERK1/2/MMP9/NANOG/SOX9［9］、PI3K/Akt［10］、Wnt/β⁃catenin［11］、MAPK/JNK/p38［12］等多条信号通路与卵巢癌的侵袭转移密切相关，其中Wnt/β⁃catenin 信号通路可能是较为重要的一条，它在卵巢癌的发生、耐药及转移中都发挥着关键作用［13-14］。为了明确RBP2 是否通过Wnt/β⁃catenin信号转导通路参与了卵巢癌的侵袭转移，本实验研究了Wnt/β⁃catenin 信号通路中的3 个重要信号蛋白，即β⁃catenin、VEGF 与MMP⁃2 的表达水平和RBP2 间的关系。结果表明，当沉默RBP2 基因后卵巢癌细胞中β⁃catenin、VEGF 与MMP⁃2 的mRNA及蛋白水平表达均显著降低，这充分说明，RBP2基因可能通过Wnt/β⁃catenin 通路调节β⁃catenin、VEGF 与MMP⁃2 的表达进而影响卵巢癌细胞的侵袭和转移。借助这一信号途径，RBP2 对癌细胞侵袭转移的调节得到级联放大的效果。因为β⁃catenin作为上游分子可以通过多个下游因子直接或间接的影响细胞的侵袭转移。ZHU 等［15］研究发现，β⁃catenin 在卵巢癌细胞中可经由PRR11（proline⁃rich protein 11）影响MMP⁃2 的表达，进而影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭。另有体外研究［16］表明，利用siRNA 靶向沉默β⁃catenin 基因阻断Wnt/β⁃catenin信号通路能明显抑制子宫内膜异位症模型裸鼠异位内膜组织VEGF 和MMP⁃9的表达及血管生成。VEGF 可以通过刺激肿瘤相关的血管生成来促进肿瘤的生长和转移，因此，VEGF 的表达水平一定程度上和肿瘤的恶性程度密切相关［17］。研究发现，VEGF⁃C 和VEGF⁃D 可促进肿瘤淋巴管的生长，促进肿瘤细胞向淋巴结的转移扩散［18］，而且VEGF⁃C还与患者的生存率密切相关。卵巢癌患者腹膜后肿瘤的进展与VEGF⁃C 的高表达有关，VEGF⁃C 高表达患者的总体生存率明显低于低表达患者［19］。MMP⁃2 也是与肿瘤侵袭和迁移密切相关的重要蛋白酶之一。LI 等［20］研究证实，MMP⁃2 的表达增加可以促进卵巢癌A2780 细胞的侵袭和迁移，而用有关抑制剂抑制其表达后，卵巢癌A2780 细胞的侵袭和迁移能力明显下降。由于VEGF 和MMP⁃2和肿瘤的侵袭转移关系密切，所以同时降低VEGF与MMP⁃2 的表达可以显著抑制卵巢癌上皮细胞的迁移和侵袭［21］。另外，一项关于直肠癌的研究表明，患者血清中VEGF 和MMP⁃2 的表达与肿瘤的浸润深度、Dukes 分期及淋巴结转移密切相关，提示VEGF 和MMP⁃2 的水平可作为判断肿瘤患者预后和预测是否转移的有效指标［22］。

综上所述，本研究从细胞层面初步证实RBP2参与了卵巢癌细胞的迁移和侵袭，其机制可能和Wnt/β⁃catenin 信号通路有关，但其如何启动Wnt/β⁃catenin 通路的信号传导及与其它促肿瘤转移因子间的作用等还需后续研究尤其是动物实验的探讨和验证。