超声微泡介导Caprin⁃1⁃KO转染对人肝癌HepG2细胞增殖、周期及cyclinD1、cyclinD2表达的影响

陈佳琳 林翠燕 赖美燕 林健如 张慧 过新民

暨南大学附属广州红十字会医院超声医学科（广州510220）

超声靶向微泡破坏（UTMD）是一种具有无创性介导基因定位释放的新型基因递送技术，可作为当前基因治疗的有效方法之一。肝细胞性肝癌（HCC）在肿瘤中发病率位居第六位，是全球第四大癌症死亡原因，目前治疗方法逐步多样化及综合化，基因治疗是当前研究的热点［1-2］。近年来发现microRNA 等小分子可以通过抑制细胞周期蛋白，如CDK1、CDK2、cyclinD1 等影响HCC 的细胞增殖、周期等生物学特性［3］。Caprin⁃1 是一种广泛表达的RNA 结合蛋白，不仅能通过控制相关基因的调节来影响细胞周期，其聚合物也可参与多种恶性肿瘤的发生发展，具有成为生物标志物和治疗新靶标的潜力［4-5］。目前已有文献报道Caprin⁃1 与HCC 的发生、预后及术后早期复发具有一定的相关性［6］，但Caprin⁃1 对HCC 的作用及机理研究均较少。本实验拟构建并筛选Caprin⁃1 敲除质粒、观察超声微泡介导其转染对人肝癌HepG2 细胞增殖、周期及cyclinD1 及cyclinD2 表达的影响，为进一步研究Caprin⁃1 表达异常在肝癌发病机理中的作用提供思路，为肝癌的靶向治疗提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂pX330质粒载体系统（CRIS⁃PR/Cas 系统）（辉园苑公司，货号：#HYY2001）、HepG2 人肝癌细胞（广州辉园苑医药科技有限公司）、Bsmb1 内切酶（NEB 货号：#R0580S）、T4 DNA连接酶（Thermo，货号：EL0011）、Trans5a 感受态细胞（Transgene，货号：CD201⁃02）、Anti⁃CAPRIN1抗体（abcam，货号ab38859）、β⁃Actin 抗体（博士德，货号BM0627）、兔抗羊IgG⁃HRP（博士德，货号BA1060）、GAPDH 抗体（Proteintech，货号10494⁃1⁃AP）、羊抗兔IgG⁃HRP（博士德，货号BA1054）、羊抗小鼠IgG⁃HRP（博士德，货号BA1050）、RNA pure总RNA快速提取试剂盒（离心柱型）（BIOTEKE，货号：RP1201）、注射用六氟化硫微泡（声诺维，Bracco Suisse SA，国药准字J20130045）、CCK⁃8 试剂盒（BEYOTIME）、东芝超声诊断仪（Apilo 500）。

1.2 实验方法

1.2.1 Caprin⁃1 敲除载体构建设计测序引物JDsgRNA⁃R、Caprin⁃1敲除质粒KO⁃1及KO⁃2引物序列（表1），CRISPR/Cas载体用内切酶Bsmb1酶切，将KO⁃1 及KO⁃2 引物序列通过连接酶与酶切位点结合，采用Trans5a 感受态细胞进行转化，筛选阳性菌株并通过引物JDsgRNA⁃R 测序鉴定，按试剂盒要求提取、纯化质粒，跑胶鉴定质粒构建成功。

1.2.2 实验分组（1）NC 组：微泡浓度（5%）+空载质粒（2 μg）+无血清培养基（DMEM）；（2）实验组1：微泡浓度（5%）+Caprin⁃1⁃KO⁃1（2 μg）+无血清培养基（DMEM）；（3）实验组2：微泡浓度（5%）+Caprin⁃1⁃KO⁃2（2 μg）+无血清培养基（DMEM）。

1.2.3 超声辐照转染采用课题组前期实验成果，设置最佳转染条件（频率2.0 MHz，MI：0.37，时间：20 s）［7］，将适量耦合剂置于超声诊断仪的探头上后置于培养板底部，对三组细胞分别进行辐照处理，之后在37 ℃，5%CO2的培养箱中继续培养。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.4 Western blot 检测Caprin⁃1 蛋白的表达和筛选最优质粒将收集三个组的细胞分别加入细胞裂解液。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移到PVDF 膜中并封闭膜。与一抗Caprin⁃1 和GAPDH 孵育，在4 ℃摇床过夜后，用TBST 洗膜，在室温下再用二抗孵育1 h，继续洗膜，ECL 化学发光法进行显示、定影。用IPP6.0 软件分析蛋白质条带的IOD 值。

1.2.5 CCK⁃8 法检测细胞增殖取经转染后的对照组及实验组细胞，经0.25%胰酶消化后制成细胞悬液，以200 μL/孔接种在96 孔板中，并做好标记，各组重复三次。放入培养箱（37℃，5% CO2）中预培养。将20 μL/孔CCK⁃8 溶液加入到各组中，将培养板在培养箱内孵育，待4 h 后使用酶标仪测定在波长为450 nm 处的吸光度值（OD值）。继续培养，分别于24、48 及72 h 时测定吸光度。

1.2.6 FCM 检测细胞周期取经转染后培养的HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1 组及HEPG2⁃KO⁃NC 组细胞，离心后收集细胞，PBS 清洗细胞2 次。加入70%预冷乙醇中使细胞重悬，吹散后于4℃固定1 ～2 h。继续离心，用PBS 清洗细胞1 次，加入500 μL PBS，避光在4℃下孵育30 min。用流式细胞仪检测。

1.2.7 qPCR 法测定细胞中cyclinD1和cyclinD2的表达量取经转染处理后的实验组（HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1）及对照组细胞（HEPG2⁃KO⁃NC），按试剂盒要求，先利用RNA pure 快速提取试剂盒提取总RNA、再对总RNA 进行反转录，最后按照qPCR 试剂盒说明进行qPCR 反应并跑胶验证，基因相对表达变化量采用2⁃△△CT（Livak）方法计算。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，数据为计量资料时以均数±标准差表示，两样本比较用t检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Caprin⁃1⁃KO 构建结果质粒Caprin⁃1⁃KO⁃1与Caprin⁃1⁃KO⁃2 的结构图谱分别见图1、2。选取0.5 μg 质粒进行酶切鉴定质粒质量，结果见图3、4，条带大小符合预期。进一步将构建的质粒送公司测序，图5、6 所示测定序列与原设计相符，表明质粒构建成功。

图1 Caprin⁃1⁃KO⁃1 的质粒结构图谱Fig.1 Plasmid structure map of Caprin⁃1⁃KO⁃1

图2 Caprin⁃1⁃KO⁃2 的质粒结构图谱Fig.2 Plasmid structure map of Caprin⁃1⁃KO⁃2

图3 Caprin⁃1⁃KO⁃1 质粒进行酶切鉴定结果Fig.3 The result of restriction digestion of Caprin⁃1⁃KO⁃1 plasmid

图4 Caprin⁃1⁃KO⁃2 质粒进行酶切鉴定结果Fig.4 The result of restriction digestion of Caprin⁃1⁃KO⁃2 plasmid

图5 Caprin⁃1⁃KO⁃1 质粒测序结果Fig.5 Sequencing results of Caprin⁃1⁃KO⁃1 plasmid

图6 Caprin⁃1⁃KO⁃2 质粒测序结果Fig.6 Sequencing results of Caprin⁃1⁃KO⁃2 plasmid

2.2 Western blot 法鉴定转染后HepG2 细胞中Caprin⁃1 的IOD 值根据图7、8 结果示，与NC 组及KO⁃1 组相比，KO⁃2 组转染后Caprin⁃1 相对表达量IOD 值明显最低（P ＜0.05）。这表明用于后续细胞学研究的最优质粒为KO⁃2 组（稍后命名为Caprin⁃1⁃KO）。

图7 不同质粒Caprin⁃1 蛋白鉴定结果Fig.7 Caprin⁃1 protein identification results of different plasmids

图8 不同质粒在最优转染条件下Caprin⁃1 蛋白的相对表达量Fig.8 The relative expression of Caprin⁃1 protein of different plasmids under optimal transfection conditions

2.3 CCK⁃8 法检测Caprin⁃1⁃KO 表达对HepG2细胞增殖抑制的影响见图9，在4 h 时，实验组与对照组细胞的OD值差异无统计学意义；当培养时间点在24、48 和72 h 时，HEPG2⁃KO⁃NC 组细胞OD值明显高于HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1 组，且随着时间的推移，OD值的差异增大（P＜0.05），这表明Caprin⁃1 为HepG2 细胞的促癌基因，Caprin⁃1⁃KO被转染后，细胞活性减弱，可抑制细胞增殖。

图9 不同时间培养人肝癌HepG2 细胞增殖的OD 值情况Fig.9 The OD value of the proliferation of human liver cancer HepG2 cells cultured at different times

2.4 FCM检测Caprin⁃1⁃KO表达对细胞周期阻滞的影响见图10、11，细胞周期各期均有统计学意义，在G0/G1 期，HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1 组的HepG2细胞数量较HEPG2⁃KO⁃NC 组明显增多，S 期及G2/M 期数量则明显下降。这说明Caprin⁃1⁃KO 可使人肝癌HepG2 细胞的细胞周期阻滞于G0/G1 期。

图10 抑制Caprin⁃1 表达后对人肝癌HepG2 细胞周期影响结果Fig.10 The result of inhibiting Caprin⁃1 expression on the cell cycle of human liver cancer HepG2

2.5 qPCR 法检测Caprin⁃1 对细胞cyclinD1 和cy⁃clinD2 的表达量的影响见图12，在HEPG2⁃KO⁃CARPIN1 组中细胞的cyclinD1 和cyclinD2 均表达下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。表明Cap⁃rin⁃1 敲除后细胞周期受到阻滞，抑制肝癌细胞的增殖。

3 讨论

图11 两组周期结果图Fig.11 Cell cycle result of the two group

目前，对肝细胞性肝癌（HCC）治疗的研究已经到达分子生物学水平，该治疗方式对早期诊断无症状的HCC、预测肝癌患者手术治疗后复发及转移的能力，从而改善患者的预后十分重要［8-9］。分子生物标志物如高尔基体蛋白73（GP73），磷脂酰肌醇聚糖3（GPC⁃3），甲胎蛋白异质体3（AFP⁃L3）等［11-12］，与传统的临床病理学指标相比具有更强的预测能力［10］。但对于晚期患者来说其临床应用效果仍然不理想。因此，发现HCC 的新预后生物标志物仍然很重要，有利于患者的治疗和改善患者预后。

图12 HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1 细胞中cyclinD1，cyclinD2 的表达量Fig.12 The expression levels of cyclinD1 and cyclinD2 in HEPG2⁃KO⁃CAPRIN1 cells

Caprin⁃1 是脊椎动物中普遍表达、高度保守的细胞质磷蛋白，由709 个氨基酸组成，含有RNA 结合蛋白特有的RGG 序列［4］。其与细胞增殖密切相关，缺乏Caprin⁃1 可能会阻滞细胞周期内G1 期至S期的进展［13］。Caprin⁃1 与多种恶性肿瘤密切相关，在不同的肿瘤细胞中，Caprin⁃1 及其相关蛋白可通过多种信号转导路径影响疾病进展。Caprin⁃1 在乳腺癌细胞中是miR⁃223的靶标，通过调控Caprin⁃1 miRNA 的3′非翻译区（3′UTR）抑制癌细胞的增殖及侵袭［14］。Caprin⁃1 在骨肉瘤细胞中可通过激活ERK1/2 及Akt 通路参与细胞增殖，凋亡和转移［15］。在结肠癌中，miR⁃193a 高表达可抑制Caprin⁃1/G3BP⁃1/c⁃MYC/Cyclin D2 表达，并可引起细胞周期G1 期停滞从而使细胞增殖受到抑制，表明Caprin⁃1可能对结肠癌的诊疗有潜在的应用价值［16］。在HCC中，TAN等［17］发现Caprin⁃1高表达与HCC 总生存率存在显著负相关，可独立预测HCC 患者的预后，这表明Caprin⁃1可能与与HCC疾病的发生发展有一定的联系。在本研究中，通过UTMD 法将构建的质粒Caprin⁃1⁃KO 转染入人肝癌HepG2 细胞，用于抑制培养细胞中Caprin⁃1 的表达。研究结果表明，抑制Caprin⁃1 表达后，cyclinD1 和cyclinD2 均表达下调，cyclinD1 和cyclinD2 为细胞周期蛋白家族的成员，参与细胞周期进程的调节，以使G1 转变为S 期［18］，与细胞生长密切相关。进一步实验发现抑制Caprin⁃1 表达后，细胞增殖受到抑制，细胞周期阻滞细胞在G0/G1 期。细胞周期的有序进行依赖于细胞周期检查点蛋白的质量控制，G1⁃S 检查点决定细胞的增殖，当细胞周期受到阻滞时，说明了DNA 出现了损伤，阻滞是为了给细胞提供修复损伤的时间，从而减少突变，避免肿瘤发生［19］。本研究并未进一步探索Caprin⁃1 与cyclinD1、cy⁃clinD2 的相互关系，Caprin⁃1 作用于cyclinD1/D2 mRNA 是否可激活细胞内相关调节通路来影响细胞增殖有待进一步探索。

综上，Caprin⁃1 为HCC 的促癌基因，超声微泡介导Caprin⁃1 敲除质粒转染人肝癌HepG2 细胞，cyclinD1 和cyclinD2 表达下降，细胞增殖受到抑制，周期发生阻滞，表明Caprin⁃1 可能通过调节cy⁃clinD1 和cyclinD2 的表达对细胞增殖、周期产生影响，从而与HCC 疾病的进展相联系，这为进一步研究Caprin⁃1 表达在肝癌发病机理中的作用提供思路。