靶向沉默Zwilch 对人皮肤恶性黑素瘤细胞增殖及凋亡的影响

杨景煜,顾珈榕，郭 静，杨 瑞，王文成，李云凤，徐 平，顾金海

皮肤恶性黑素瘤(CMM)是人类皮肤癌中恶性程度最高的肿瘤[1]，发展快、转移早、易复发、预后差，目前的总体疗效并不理想[2]，亟须进一步研究以寻求有效的治疗靶点和方法。Zwilch是一种新近才被筛选出来的致癌基因，在CMM与正常组织之间表达差异极为显著，且表达水平与CMM患者的病理分级、分期等均显著相关，在CMM的临床诊治及预后评估方面极具潜在价值[3]。然而目前关于Zwilch的报道较少，作用机制仍未阐明。本研究以CMM细胞为对象，初步探讨靶向沉默Zwilch 对其增殖和凋亡产生的影响，为进一步研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：人皮肤恶性黑素瘤细胞A375购自中科院上海细胞资源中心，在含10%胎牛血清(美国HyClone)、1×105U/L青霉素(美国Sigma)、100 mg/L链霉素(美国Sigma)的DMEM培养液(美国Gibco)中于37 ℃、5% CO2条件下培养孵育，细胞系贴壁生长。分3组细胞进行实验。对照组，常规条件培养的A375细胞；sh-NC(sh-Negative Control)组：感染sh-NC慢病毒的A375细胞；sh-Zwilch组：感染sh-Zwilch慢病毒的A375细胞。sh-NC、sh-Zwilch慢病毒均购自上海吉凯基因技术公司。感染时，选择状态良好的A375细胞，以5×104个/孔接种于12孔板，37 ℃、5% CO2培养至细胞融合度达到30%，按照MOI=2.0加入0.9 μL慢病毒，采用Normal+Polybrene的方式感染，培养24 h 后更换培养基，继续感染72 h 后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况。

1.2 主要试剂材料：兔抗人Zwilch单克隆抗体购自英国Abcam公司，GAPDH 多克隆抗体(AB-P-R 001)购自杭州贤至生物科技有限公司。PCR试剂盒购自Promega公司，引物由上海生工合成。Western blotting相关试剂、Annexin V/PI凋亡检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。CCK-8试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 实时荧光定量LPCR检测mRNA表达：sh-RNA感染A375细胞72 h 后观察GFP 荧光率大于80%者分于12孔板中培养，长满后收集细胞，PBS清洗3次，依据操作手册用TRIzol 试剂盒提取总RNA，用GoScriptTM Reverse Transcription System进行逆转录和 PCR 扩增。Zwilch引物序列：上游为5’-CGTCTCCTTCAGCTGATGTCC-3’，下游为5’-TGGTCCAACATTTTCGCCAGT-3’；GAPDH引物序列：上游为5’- CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’，下游为5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’。PCR反应条件为95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共35个循环后再72℃延伸6 min。以2-ΔΔCt值(Ct 代表循环阈值)表示Zwilch mRNA的相对表达量。每组实验均重复5 次。

1.4 Western blotting检测蛋白表达：sh-RNA感染A375细胞72 h 后观察GFP 荧光率大于80%者分于6孔板中培养，长满后收集细胞，加入预冷裂解液在冰浴中充分裂解细胞，提取全蛋白，BCA法分析定量。取10 μg总蛋白样品，用10%的TrisGlycine胶进行 SDS-PAGE 电泳，并转移至PVDF膜上，用TBST配制的牛奶封闭1 h，加入一抗(体积稀释比为1∶3 000)4 ℃ 孵育过夜。其后用TBST洗膜5 min，用荧光二抗(体积稀释比为1∶5 000)避光室温孵育1 h，TBST洗膜5 min 5次后用奥德赛(ODYSSEY CLx)曝光。扫描灰度并计算蛋白相应的表达量。每组实验均重复5 次。

1.5 CCK-8检测细胞增殖：sh-RNA感染A375细胞72 h 后观察GFP 荧光率大于80%者分于24孔板接种5×104个细胞，细胞悬液体积为1 mL，在37 ℃ 5%CO2培养箱中培养1～5 d 后，每孔加入100 μl CCK-8液，继续在培养箱中孵育1 h，用酶标仪测定450 nm波长的吸光度(D450)。每组实验均重复5 次。

1.6 Annexin V/PI双染检测细胞凋亡：sh-RNA感染A375细胞72 h 后观察GFP 荧光率大于80%者分于6孔板中培养，长满后收集细胞，PBS洗涤2次，2 000 rpm离心2 min，弃上清，加入500 μl binding buffer悬浮细胞，加入5 μl Annexin V混匀后，再加入5 μl PI混匀，室温避光孵育15 min，用流式细胞仪进行检测。每组实验均重复5 次。

2 结果

2.1 shRNA慢病毒感染对A375细胞Zwilch mRNA及蛋白表达的影响：实时荧光定量PCR及Western blotting结果显示，慢病毒感染72 h后，与对照组比较，sh-Zwilch组细胞的Zwilch mRNA及蛋白表达水平均显著下降(P<0.05)，而sh-NC则无明显影响。这表明shRNA慢病毒能够靶向沉默人CMM 细胞A375中 Zwilch 的表达和作用，从而为后续实验奠定基础。

2.2 靶向沉默Zwilch对A375细胞增殖的影响：CCK-8结果显示，慢病毒感染实现Zwilch靶向沉默后1 d ，sh-Zwilch组细胞的活性比对照组显著降低(P<0.05)；其后随时间延长到2～5 d 时，细胞活性的降低更加明显(P<0.05)。这表明靶向沉默Zwilch能够随时间抑制A375细胞的增殖，从而为后续以Zwilch为靶点进行人皮肤黑素瘤靶向治疗提供实验依据。

2.3 靶向沉默Zwilch对A375细胞凋亡的影响：流式细胞检测结果显示，慢病毒感染实现Zwilch靶向沉默后，sh-Zwilch组细胞的凋亡率比对照组明显增多(P<0.05)(图1，目录后)，表明靶向沉默Zwilch能够促进人CMM 细胞A375的凋亡，为其机制研究提供依据。

3 讨论

人皮肤恶性黑素瘤(CMM)是一种转移早、发展快、治疗难、预后差的高恶性肿瘤，瘤细胞的异常增殖是其突出的生物学特性，过程很复杂，但归根结底是由肿瘤细胞的异常有丝分裂造成的[4-5]。研究表明，真核生物的细胞有丝分裂是一个精巧复杂的调控过程，必须由纺锤体组装检验点(SAC)实时监控才能保证遗传信息的平均分配[6]。而SAC系统则由主要成分(Mad1/2/3、BubR1、Bub1/3等)、动粒蛋白(RZZ复合体、Ndc80复合物等)、微管马达(dynein、CENP-E等)及效应器(cdc20、APC/C等)四部分组成[7]。其中RZZ复合体主要由Rough Deal(Rod)、Zeste-white 10(Zw10) 和 Zwilch组成，在细胞有丝分裂中起着募集dynein/dynactin、Mad1-Mad2到着丝粒并促进受体结合，以保证有丝分裂正常进行的重要作用[8-11]。目前研究已经证实RZZ复合体与多种恶性肿瘤的发生密切相关[12]。

Zwilch是RZZ复合体中目前研究最少的一种成分，直到2002年才在果蝇中被发现[13]。我们的前期研究表明，Zwilch在CMM与正常组织之间表达差异极为显著，且其表达水平与CMM患者的病理分级、分期等均显著相关，在CMM的临床诊治及预后评估方面极具潜在价值[3]。因此本课题对靶向沉默Zwilch对CMM细胞增殖和凋亡的影响进行了基础研究。结果显示，通过shRNA慢病毒感染实现Zwilch靶向沉默后，A375细胞的细胞活性显著降低(P<0.05)，细胞凋亡率明显增多(P<0.05)。这些结果表明，靶向沉默Zwilch能够抑制人CMM 细胞的增殖并促进其凋亡，从而为进一步研究Zwilch在人CMM发病中的作用及机制、以及后续以Zwilch为靶点进行人皮肤黑素瘤靶向治疗提供了实验依据。