血清生长分化因子-15、SYNTAX评分在急性冠脉综合征中的相关性及对患者心血管事件的作用和机制研究

马宇凌，谢 忠，刘彦武，周 伟，张 磊，李 娜，杨学龙，张卓豪，王 静

急性冠状动脉综合征(ACS)是心血管疾病主要的危急症，具有较高的发病率和致死率，主要的发病机理是冠状动脉粥样硬化和斑块的形成，而这也与冠状动脉疾病的预后密切相关，单核、巨噬细胞的激活在动脉粥样硬化和斑块形成中起着重要作用，参与了冠状动脉疾病的进展，筛选生物标志物作为预后评估的工具具有重要的潜在预防和治疗意义[1]。生长分化因子-15(GDF-15)是一种相对较新的生物标记物，是转化生长因子β(TGF-β)超家族中的一种蛋白，由心肌细胞和活化的巨噬细胞产生和分泌[2]。单核、巨噬细胞的激活与冠状动脉粥样硬化的发病密切相关[3]，因此研究GDF-15预测未来主要心血管不良事件(MACE)风险至关重要。研究证实，SYNTAX评分与不同疾病严重程度患者的MACE相关[4]。TGF - β RI/Smad是TGF-β信号下游的重要调节信号[5]。因此，本文主要研究GDF-15与SYNTAX评分在非ST段抬高急性冠脉综合征(NSTEACS)患者MACE风险预测的相关性，并探讨可能的调节机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2017年1月-2019年12月我院心内科收治的NSTEACS且至少有1处狭窄>50%的患者104例，其中男性58例，女性46例，平均年龄(61.20±10.56)岁。排除既往心肌梗死史、冠状动脉搭桥术史、全身炎症史、肝肾功能衰竭和患有恶性疾病。本研究经过医院伦理委员会同意，患者均知情并签订知情同意书。

1.2 仪器和试剂：酶标仪 (SPECTE RAmax190，Thermo Fisher公司)；CFX-96 PCR系统(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)；GDF-15和IL-1β的ELISA试剂盒购自于Elabscience公司。

1.3 研究方法:入院当日收集临床资料，包括年龄、性别、心血管危险因素，收集冠状动脉造影、生化指标及出院时的药物治疗情况。入院次日清晨抽取空腹静脉血，离心收集血清，置于-80 ℃保存；正常体检者体检当日采集空腹静脉血，离心收集血清，置于-80 ℃保存。

采用ELISA 法检测血清中GDF-15和IL-1β水平，实验过程严格按照试剂盒使用说明进行。血清进行倍比稀释，配制标准品并绘制出标准曲线，加入生物素化抗体100 μL/孔，室温孵育60 min；辣根过氧化物酶标记液100 μL/孔，室温避光孵育20 min，显色剂溶液100 μL/孔，室温避光孵育20 min；终止液50 μL/孔，混匀后立即测量A450值。根据所绘制的标准曲线，计算所测样品的含量，并进行统计分析。

实时荧光定量 PCR(qPCR)检测TGF-RI/Smad信号表达情况，使用TRIzol试剂提取血液中的总mRNA。使用逆转录试剂盒对500 ng总RNA进行反转录，并将合成的 cDNA与荧光染料一起用于实时聚合酶链反应。采用CFX-96 PCR系统(Bio-Rad，Hercules，CA，美国)进行cDNA的PCR扩增。引物序合成由生工生物工程(上海)股份有限公司进行。使用 2-ΔΔCt方法评估mRNA的相对转录水平。所有实验均重复三次。引物:TGF-RI:forward，5′-TAGCAGCAGACAATAAAGACA-3′，reverse，5′-ATGTGAAGATGGGCAAGACC-3′；Smad2:forward，5′-GCCCTTGAAAGTTCTTACCT-3′，reverse，5′-TCAATCCCAGGCACTTTAGG-3′；Smad3:forward，5′-CACATTGACTGGGAAACCTG-3′，reverse，5′-CTGAGATGTTTCCCTTCTGG-3′；-actin:forward，5′-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3′，reverse，5′-GGCATAGAGGTCTTTACGG-3′。

根据冠状动脉疾病定义(至少1条冠状动脉狭窄>50%)，通过评估冠状动脉狭窄程度>50%和直径>1.5 mm的每个病变的总分，计算每个患者的SYNTAX总分[6]。在接受经皮冠状动脉介入治疗(PCI)的NSTEACS患者中，所有患者服用300 mg阿司匹林治疗，PCI时服用600 mg氯吡格雷。术后服用阿司匹林100 mg/d；氯吡格雷75 mg/d，共1年。

进行出院后两年随访，根据是否存在MACE对患者进行分层，分析MACE(即心血管死亡、非致命性心肌梗死或不稳定心绞痛再入院的综合结果，随访再住院或死亡情况)风险预测中GDF-15和SYNTAX评分之间的关系，并分析GDF-15和IL-1β炎症指标在NSTEACS风险预测中的作用。

2 结果

2.1 一般临床资料分析:一般临床资料分析见表1。

表1 104例NSTEACS患者的一般资料分析

2.2 NSTEACS患者合并心血管事件的比较分析：共有104例NSTEACS患者被纳入研究。在2年的随访中，31例患者(29.81%)合并心血管事件。患者的临床、血管造影和生化特征如表2所示，根据有无心血管事件分类，单因素分析显示SYNTAX评分(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)和GDF-15血清浓度(P<0.05)差异具有统计学意义(P<0.05)。GDF-15三分位法后的Kaplan-Meier生存曲线显示：与最低的三分位数相比，最高三分位数的参与者有更高的MACE发生率。

表2 104例NSTEACS患者合并心血管事件的比较分析

变量有(n=31)无(n=73)P值左心室射血分数(%,x±s)54.12±7.6656.11±8.23>0.05肌钙蛋白I(ng/mL,x±s)37.13±21.5032.55±19.54>0.05红细胞压积(%,x±s)38.77±6.4339.65±5.22>0.05血红蛋白(mg/dl,x±s)13.2±3.5913.7±5.61>0.05白细胞(109/L,x±s)11.21±2.449.54±3.18>0.05总胆固醇(mg/dL,x±s)172.51±22.67171.39±32.89>0.05肌酐(mg/dL,x±s)1.12±0.530.93±0.42>0.05GDF-15(pg/mL)3261.51[2450～5680]1987.89[1323～2489]<0.05IL-1β1392.77[823-1922]388.10[122-611]<0.05SYNTAX评分26[24-31]19[15-22]<0.05治疗[n(%)] 阿司匹林31(100)73(100)>0.05 氯吡格雷26(83.87)61(83.56)>0.05 他汀类31(100)73(100)>0.05 ACEI24(77.42)55(75.34)>0.05 -阻滞剂25(80.65)62(84.93)>0.05 抗糖尿病药物11(35.48)23(31.51)>0.05

2.3 NSTEACS患者血清中GDF-15与SYNTAX评分的相关性分析:结果显示，GDF-15与SYNTAX评分呈中度正相关(r=0.41，P<0.05)。在GDF-15患者中，GDF-15患者发生心血管死亡、非致命性心肌梗死或因不稳定心绞痛再次入院的主要转归发生率为49.04%(51/104)。

2.4 NSTEACS患者的多因素预测因素分析：结果显示，在Cox回归分析中，GDF-15水平(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)和SYNTAX评分(P<0.05)是独立预测因子，见表3。与SYNTAX评分的回归模型相比，附加GDF-15分析后显示Harrell's C显著增加(Harrell's C由0.82增加至0.91)，而Akaike信息准则显著减少(由1207减少至1012)。

表3 104例NSTEACS患者的多因素预测因素分析

2.5 GDF-15、SYNTAX评分和IL-1β的ROC曲线：GDF-15曲线下面积(AUC)高于IL-1β曲线下面积(P<0.05)，SYNTAX评分差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6 TGF- RI/Smad的mRNA表达比较：根据GDF-15表达的三分位法将患者分为3组，分别检测TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表达。结果表明，GDF-15高表达组和中表达组TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表达明显高于GDF-15低表达组(P<0.05)。GDF-15高表达组TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表达明显高于中表达组(P<0.05)。

3 讨论

急性冠状动脉综合征包括不稳定型心绞痛，非ST升高的心肌梗塞(NSTEMI)和ST升高的心肌梗塞(STEMI)，其中NSTEACS是一种常见的心血管疾病，是心肌梗死最严重和最致命的形式之一，严重威胁患者的生命安全[7]。

SYNTAX评分是一种基于病变的血管造影评分系统，已广泛用于对冠状动脉疾病的复杂性进行评分，量化病变的严重程度，并预测不良的心血管后果[8]。研究显示，患者具有相对较高SYNTAX评分，有更差的心血管结局是MACE经皮冠状动脉介入治疗的独立预测因子[9]。与其他研究结果一致，我们发现SYNTAX评分可以预测NSTEACS患者2年随访期间的不良心血管事件。

GDF-15是TGF-β细胞因子超家族的成员，该家族成员在健康条件下表达较弱，但能够因响应氧化应激、炎症和组织损伤而产生，是急性冠脉综合征患者的一个预后标志物[10]。与稳定型心绞痛患者相比，NSTEACS患者的冠状动脉斑块具有更广泛的巨噬细胞浸润[11]。GDF-15的循环浓度在动脉粥样硬化中的浓度增加，是未来心血管事件的重要预测因子[12]。在梗死的心肌中检测到GDF-15的表达，高水平的GDF-15与在NSTEACS死亡或心肌梗死的风险增加有关[13]。我们的研究与其他结果类似，高水平的GDF-15与随访2年后的心血管事件相关。

此外，我们发现SYNTAX评分与GDF-15水平呈显著正相关。我们的研究发现，除了SYNTAX评分、IL-1β和GDF-15血清浓度差异具有统计学意义外，其他因素与NSTEACS患者心脏不良事件的发生之间没有显著的相关性。这可能是由于本研究是观察队列研究，不能排除未测量变量中的混杂因素，且有限的患者数量可能会影响统计分析。

GDF-15是TGF-β超家族中的一种蛋白，由心肌细胞和活化的巨噬细胞产生和分泌，而TGF - β RI/Smad是TGF-β信号下游的重要调节信号，并参与了NSTEACS的发生发展[14]。在本研究中，我们发现低表达GDF-15患者中TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表达较低，而高表达GDF-15患者中TGF- RI、Smad2、Smad3的mRNA表达明显增高。这提示TGF- RI/Smad信号在GDF-15参与NSTEACS疾病中发挥着作用，研究明确了TGF-β能调节TGF- RI/Smad信号通路[15]，我们可以提出GDF-15可能通过调节TGF - β RI/Smad信号参与了NSTEACS疾病的发展。

总之，NSTEACS患者入院时GDF-15水平与SYNTAX评分相关，并且在2年随访期间与MACE风险增加独立相关，可能通过调节TGF-β RI/Smad信号发挥作用。为NSTEACS诊断及治疗提供了一定的依据。