胃俞募配穴对脑岛味觉皮层损毁功能性消化不良大鼠脑功能网络连接的影响

陈媛，张璞玥，龙涛，赵映，石宇，郑华斌

(1.成都中医药大学 针灸推拿学院，四川 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院 针灸科，四川 成都 610072)

功能性消化不良(Functional Dyspepsia,FD)是一种临床多发的胃肠道功能性疾病。胃俞募配穴是治疗FD的经典选穴方案，但目前其机制尚未完全明确。脑岛是重要的“内感受皮层”。研究表明，脑岛不仅是FD病理改变的重点脑区，也是FD针刺治疗有明显响应的脑区[1-2]。课题组前期以小动物fMRI为手段，发现胃俞募配穴对FD大鼠脑岛与下丘脑、丘脑、海马等功能连接度异常改变有一定调节作用[3]。本研究继续以FD大鼠为疾病载体，采用鹅膏蕈氨酸损毁脑岛味觉皮层以屏蔽部分脑岛皮层效应，逆向探究胃俞募配穴对FD大鼠全脑功能连接的影响，为进一步解释针刺治疗FD的中枢机制提供依据。

1 实验材料与设备

1.1 实验动物与分组

将60只7日龄雄性SD大鼠乳鼠随机分为手术组、手术针刺组与假手术组，均提供母乳喂养。乳鼠由成都达硕实验动物有限公司分批提供(合格证号：SCXK(川)2015-030)。实验分两阶段，第一阶段在成都中医药大学针灸推拿学院动物实验室进行，第二阶段在中国科学院武汉物理与数学研究所实验室进行，饲养条件一致。

1.2 主要试剂及仪器

碘乙酰胺(美国SIGMA公司,批号：Y1456CI)，鹅膏蕈氨酸(美国SIGMA公司,IBO,12765-1MG,批号：0447683849;)，磷酸缓冲盐溶液(美国Hyclone公司,批号：00679)，酮咯酸氨丁三醇注射液(山东新时代药业有限公司,批号:035180409)，3%异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司,批号：R510-22)。大鼠脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型号：68526)，G6805-II型电针仪(青岛鑫生实业有限公司)，7.0 T小动物成像仪(德国bruker公司)。

2 实验方法

2.1 模型制作与脑岛损毁

采用复合因素造模，获得更稳定FD模型[4]。7日龄雄性乳鼠，采用0.1%碘乙酰胺和2%蔗糖混合液0.2 mL/d，连续灌胃6 d[5]。出生第22天行母鼠隔离，避免因母婴分离形成肠易激综合征。7周龄行脑岛皮层损毁手术(见图1)：5%异氟烷吸入麻醉大鼠，运用脑立体定位仪微量注射药剂；手术组及手术针刺组，采用1 mg IBO和0.2 mL PBS(5 mg/mL)溶液混合注射于大鼠脑岛味觉皮层(AP,+0.5 mm；ML,±5.6 mm；DV,6.6 mm)[6]，术后以酮咯酸氨丁三醇镇痛(2 mg/kg)，青霉素抗感染；假手术组，只注射等量PBS溶液；采取HE染色和尼氏染色，对IBO损毁脑岛皮层进行组织学验证。术后观察10 d,进行下阶段造模：自制棉布包裹塑料夹钳固定于大鼠尾末端1/3处，大鼠暴怒，前肢离地，与笼内大鼠打斗，不破皮为度，每日早晚2次，30 min/次，连续14 d；单日禁食，双日给足量食物；饮水正常。

图1 行IBO注射损毁脑岛皮层

2.2 针刺方法

造模后第2天，手术针刺组每日取中脘和胃俞参考2016年人民卫生出版社《实验针灸学》，不予手法刺激，连接电针仪并以疏密波刺激，电压2～4 V，频率20～100 Hz，留针20 min，连续治疗10 d。手术组和假手术组，固定不针刺。

2.3 数据统计分析

每组6只大鼠通过4%异氟烷气体麻醉后，行7.0T小动物fMRI扫描。BOLD 数据采集时，采集EPI序列2～3次，再采集T2结构像。运用spmIHEP工具包[7]对数据行图像预处理，分割脑区，提取数据和脑区间功能连接计算。统计学分析均采用SPSS 20.0及Graphpad Prism处理。

3 实验结果

3.1 损毁脑区组织学验证

3.1.1 HE染色结果

观察接受IBO注射的手术组和行PBS注射的假手术组大鼠脑岛味觉皮层HE染色情况(见图2)：手术组神经细胞皱缩、细胞体积减小、细胞核浓缩、细胞间隔增宽、损伤区结构较疏松、嗜伊红着色变浅；假手术组未见明显的组织病理损伤，皮层组织结构较正常。

3.1.2 尼氏染色结果

观察行IBO注射的手术组与仅行PBS注射的非手术组大鼠神经元变化情况：手术组大鼠脑岛区域神经元椎体细胞胞体明显缩小、数量减少、形态缺失且排列散乱，部分尼氏小体发生溶解现象，并见尼氏体浅染(图3)；非手术组大鼠脑岛区域神经元椎体细胞胞体饱满，排列紧凑，胞体内尼氏体颜色较深(图4)。

尼氏染色和HE染色结果表明，采用IBO注射损毁脑岛皮层在组织学上可行，对脑岛区域神经元损毁有意义。

手术组(100X) 假手术组(100X) 图2 光学显微镜下脑岛区域HE染色图

(40X)(200X) 图3 手术组40倍和200倍镜下观察神经元变化(∗为损毁)

(40X)(200X) 图4 假手术组40倍和200倍镜下观察神经元变化

3.2 FD模型验证

造模以后，FD大鼠出现负面情绪和胃肠不适症状，如毛色粗糙、情绪焦虑或抑郁、体型消瘦、进食饮水量减少等，结合同期实验对大鼠行为、大鼠体重改变、胃排空率、饮食量、饮水量和胃泌素检测结果，观察差异对比，均提示FD造模成功。

3.3 小动物fMRI扫描结果

行7.0 T小动物fMRI扫描，经Fisher r-to-z变换时间序列的相关系数，构建相应功能网络连接矩阵。静息态下，手术组和手术针刺组的大尺度脑网络平均功能连接矩阵(图5)。手术针刺组较手术组，功能连接强度(FC，Functional Connectivity)明显增强脑区(见图6)，FC明显减弱脑区(见图7)。

手术组手术针刺组图5 全脑功能网络连接矩阵

注：*表示脑区间FC值比较，有统计学差异(P<0.05)；A为嗅结节和缰核；B为听觉皮层和梨状皮层；C为黑质和臂核；D为丘脑和嗅结节

为：*表示脑区间FC值比较，有统计学差异(P<0.05);E为脑岛和嗅结节； F为海马和隔核

4 讨论

胃俞募配穴是针刺治疗FD的重要配穴方案，有良好临床疗效显著[8]。脑岛对于FD病理演变和调节胃肠功能都有着重要作用[9]。研究证实，脑岛也是针刺治疗FD中枢整合的关键脑区[10]。本实验基于前期研究，通过IBO损毁部分脑岛味觉皮层以屏蔽其有关情绪、摄食、内脏调节效应，深入探寻针刺胃俞募穴对FD大鼠的治疗效应和中枢脑区响应异同。

FD大鼠造模后，出现进食量明显减少，而针刺后饮食情况有较好改善。从小动物fMRI扫描结果来看，分析全脑网络FC值发现，胃俞募配穴针刺干预后，梨状皮层、嗅结节等相关嗅觉神经系统功能的功能连接强度增加，这可能因为嗅觉系统和进食状态有关、嗅觉功能障碍和认知障碍也存在密切联系[11]。嗅觉神经系统在进食行为方面发挥着重要的作用，多项研究表明嗅觉系统的响应与紧实状态密切相关。其中，嗅结节被认为是调节气味诱导动机行为的关键[12]。进食行为，除了受代谢状态影响外，还可在进食过程中获得乐趣而有所调节。

胃俞募穴针刺干预，还对边缘系统有影响，可以负向调节海马和隔核边缘系统功能连接度。隔核，是执行系统与认知中枢的中间环节，在认知、情绪、行为等方面发挥着重要影响；同时，海马和扣带皮层等边缘系统的脑区纤维，通过传入隔核，而参与认知功能，隔核的脑区纤维传出至下丘脑，还参与了情绪调节[13]；海马是重要的认知功能脑区，在行为奖赏、抑郁情绪方面发挥着重要作用[14]；有研究认为，海马与隔核都参与了控制摄食情感的喂 养回路[15]；有研究还发现下丘脑弓状核和外侧隔核可构成生长激素释放肽通路以调控胃肠运动[16]。研究还发现针刺干预后，梨状皮质、基底神经节嗅结节、黑质等多个脑区的响应改变，可能与多巴胺神经系统回路对胃肠动力和摄食级情绪的影响相关。

由于受小动物影像学研究的条件限制，本研究样本量有限，针刺胃俞募配穴治疗FD的中枢机制仍有待我们进一步研究。