逐瘀汤对子宫内膜异位症大鼠白介素6、白介素8和肿瘤坏死因子α的影响

张璇，庄良武，陈蓉艳，杨直，林妍

(福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004)

近期研究皆认为妇科常见疑难多发病——子宫内膜异位症(Endometriosis，EM)伴有明确的炎性改变,目前临床上EM的治疗以手术、药物及其联合治疗为主，可通过降低炎性因子和疼痛介质的水平，以及阻断血管的异生性来有效降低患者疼痛程度及其临床相关症状[1-2]。在 EM 治疗中中药虽然被广泛使用，但由于作用机制不完全清楚，仍受到部分质疑。本研究通过检测逐瘀汤对子宫内膜异位症大鼠白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(INF-α)的影响，探讨逐瘀汤治疗EM的作用机制。

1 材料与设备

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

雌性SD大鼠40只，清洁级，体质量180～200 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，大鼠合格证编号：2015000560034，许可证号：SCXK(沪)2017-0005，所有动物实验过程均遵循动物伦理学规范。

1.1.2 实验药物

逐瘀汤由蒲黄、五灵脂、当归、川芎、桃仁、马鞭草、元胡、炙甘草等药物组成，以上药物均由福建中医药大学附属人民医院中药房提供，分2次煎煮(第1次加3倍量水煎煮 1 h，第2次加2倍量水煎煮 1 h)，过滤，合并煎煮液浓缩至150 mL，每毫升药液相当于生药0.5 g；米非司酮，25 mg/粒,研磨成粉用蒸馏水配成0.1 mg/mL的药液(华润紫竹药业有限公司，生产批号：170401)；苯甲酸雌二醇(四川金科药业有限责任公司，生产批号：20170301)；水合氯醛(福州飞净生物科技有限公司，生产批号：201711)；庆大霉素(江西正和生物科技有限公司，生产批号：20170411)。

1.2 试剂

所用ELISA试剂盒均购自度一基地(福州)生物科技有限公司(批号：20190123)。

1.3 仪器

H1650R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；PW-812全自动酶标洗板机(深圳市汇松科技发展有限公司)；MB-530多功能酶标分析仪(深圳市汇松科技发展有限公司)；DHP-500电热恒温培养箱(北京市永光明医疗仪器有限公司)。

2 实验方法

2.1 造模及分组方法

2.1.1 造模

通过自体移植法建立EM大鼠模型[3]。术前统一发情周期：造模前3日，大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg)促情。3 d后，使用10%水合氯醛麻醉，按300 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后逐层打开大鼠腹部暴露子宫，寻找出左侧子宫，将其宫腔纵向切开，暴露子宫内膜，并切除5 mm×5 mm的子宫内膜，将切除的子宫内膜块缝合至腹腔右侧内壁血管丰富处，然后逐层缝合肌肉层和皮肤。术后，每组大鼠于腹腔注射庆大霉素0.4万U/只，连续注射5 d预防感染。手术成功后第2日起，为促进移植内膜生长，连续3 d肌肉注射苯甲酸雌二醇，剂量同前。手术成功后每周2次抚触移植包块的位置及大小。手术后3周，将大鼠麻醉，麻醉方法同前，再次进行剖腹手术查看造模情况，仔细观看异位子宫内膜包块的形态学变化，以卡尺测量EM大鼠体内生长的异位内膜包块的体积，如果包块体积≥8 mm3，或者观看到明显的异位内膜包块，或者呈透明的泡囊状，并且在泡囊内可见澄清或淡黄色的渗出物，新生血管成长于异位内膜周边为造模成功[3]。

2.1.2 分组

选取30只成功建模的SD大鼠进行随机分组，采用随机数字表法,以及随机数余数分组法分为模型组、米非司酮组及逐瘀汤组，每组10只；正常组选用正常饲养大鼠10只。

2.2 实验给药

正常组、模型组给予生理盐水15 mL/(kg·d)灌胃；米非司酮组给予低剂量米非司酮15 mL/(kg·d)灌胃[4]；逐瘀汤组给予逐瘀汤15 mL/(kg·d)灌胃，持续给药28 d后，于腹主动脉取血。实验过程中模型组及逐瘀汤组各死亡大鼠1只，具体原因为灌药过程中窒息死亡。

2.3 检测指标

治疗前取大鼠尾血，治疗后取大鼠腹主动脉血，采用ELISA法检测各组治疗前后血清IL-6、IL-8、TNF-α值，操作按说明书进行。

2.4 数据统计分析

3 实验结果

治疗前与正常组比较，模型组大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平显著升高(P<0.05)；治疗后，米非司酮组、逐瘀汤组大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平较模型组显著降低(P<0.05)；米非司酮组与逐瘀汤组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组治疗前后各组大鼠IL-6、IL-8、TNF-α水平

4 讨论

EM是一种复杂的综合征，其特征是依赖雌激素的慢性炎症过程，主要影响包括卵巢在内的盆腔组织。近期研究认为EM的发生及发展与免疫机制有着一定的联系，由于患者免疫监视功能下降，无法清除异位的内膜，使得免疫调节功能失控，造成免疫细胞产生多种细胞因子和炎症介质，分泌的炎症因子导致趋化增殖，从而促进异位内膜生长及增殖，使得EM加快发展[5-6]。

IL-6属于活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，作为标志性的炎症细胞因子，EM患者也可以从异位内膜间质细胞中大量分泌，IL-6 受体在异位内膜组织中与在位内膜组织相比显著降低，因此异位内膜对IL-6介导的生长抑制具有免疫作用[7]。IL-8属于促炎细胞因子，主要分泌于巨噬细胞和上皮细胞，主要生物学功能是在炎症反应中趋化中性粒细胞、T淋巴细胞以及嗜碱粒细胞至病灶部位，其水平的升高可对血管生成起到促进作用，而异位内膜则需要大量的新生血管，IL-8具有促进血管生成的作用，能促进EM异位灶的血管形成，使盆腔广泛粘连[8]。TNF-α主要产生于单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，属于血管活性因子之一，是具有多种生物功能的细胞因子，对炎症和免疫反应具有介导促进作用。在机体出现EM时，异位子宫内膜能够刺激机体产生体液以及细胞免疫应答，促进血管增生，刺激子宫内膜间质细胞的增殖和子宫内膜细胞的黏附，从而促进异位病灶的形成[9]。本研究中，SD大鼠EM模型的构建采用自体移植法，此法为模拟临床上疑难多发的EM最多用的方法[3]。本研究比较各组大鼠血清中与EM密切相关的炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α的水平，结果显示:建模成功的EM大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平较正常组明显升高，与以往的研究结论相符。

传统医学没有EM的记载，《古方汇精》[10]中曾记载的：“凡闺女在室行经，并无疼痛，及出嫁后，忽遇痛经，渐至滋蔓，服药罔效。此乃少年新娘，男女不知禁忌，或经将来之际，或行经未净，遂尔交媾，震动血海之络，损伤冲任，以致瘀滞凝结，每至行经，断流难畅，是以作痛，名曰逆经痛，患此难以受孕”，与目前对EM的认知高度一致，明确提出逆经痛，与目前主导地位的经血逆流学说不谋而合。随着该病的逐年增加，1990年中国中西医结合学会妇产科专业委员会发布了专家共识，提出血瘀为其根本病机[11]，将本病定为血瘀证。《血证论》[12]提出离经之血皆为瘀，凡血证总以去瘀为要，故活血化瘀为中医治疗EM的首要原则。部分医家亦证实活血化瘀类药物具有较强的抗炎作用，活血化瘀类中药能够改善EM患者的盆腔微环境，促进瘀血、盆腔炎性瘢痕的吸收，改善微循环障碍，从而改善临床的一些症状[13]。

本研究中的逐瘀汤是福建省名中医王惠珍教授的经验方，由蒲黄、五灵脂、当归、川芎、桃仁、马鞭草、元胡、炙甘草组成，方中以蒲黄、五灵脂为君，二药组合为失笑散，取失笑散化瘀止血，散瘀止痛之功效；臣以当归、川芎、桃仁，取其破血行瘀，行气止痛之功；马鞭草、元胡为佐，取其清热解毒，行气利水消肿之功；炙甘草调和诸药为使，全方共起活血化瘀，理气止痛的功效。我们团队前期研究中，已证实此方对于缓解EM的疼痛症状有明显效果，对于合并不孕的EM患者，逐瘀汤可以通经络逐瘀血增加怀孕概率[14-15]。方中的马鞭草有明确的抗菌抗炎作用[16]。基于此，本研究将逐瘀汤用于EM大鼠，结果发现：与模型组比较，逐瘀汤组大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平显著下降，证明逐瘀汤可降低EM大鼠的血清炎症因子水平，说明逐瘀汤治疗EM的作用可能是通过抑制炎症因子而缓解临床症状及延缓EM的进展。逐瘀汤组与米非司酮组比较，两组大鼠血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平均无显著统计学差异，表明逐瘀汤降低炎症因子的疗效不亚于米非司酮。2018年中国专家共识认为：手术与药物联合疗法为临床治疗EM的金标准，由于EM的高复发率，建议使用药物长期管理，避免重复手术操作[17]，在新共识指导下，中医药治疗更能凸显自己的优势。

本研究证实逐瘀汤可以降低大鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平，表明逐瘀汤可能是通过某种炎性通路降低EM大鼠炎性因子的水平从而影响EM的发展，从动物实验的角度证实癥瘕之“血瘀”与EM中的“炎症”概念在深层次上的联系，但仍未阐明其具体的机制。在下一步的研究中，我们拟探明逐瘀汤治疗EM的具体信号通路机制，为其在EM中的临床应用提供理论支持。