苓桂术甘汤对肺动脉高压致右心衰大鼠心功能、神经内分泌因子水平及心脏组织NF-κB蛋白表达的影响

李白雪,黎桂玉,彭杨芷,刘蕾,蒋萃,姜岑▲

(1.成都中医药大学 基础医学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610075)

肺源性右心衰竭是由多种因素引起的肺动脉高压所致的右心室负荷加重，最终引起右心室扩大，心力衰竭的一种疾病，是我国常见病、多发病。该病临床症状复杂，而许多临床症状都与右心舒缩功能降低和水钠潴留相关，同时右心功能也是多种心肺疾病转归和预后的重要决定因素。目前临床治疗以预防呼吸道感染，强心、利尿等方式为主。中医药在防治肺心病右心衰方面积累了较为丰富的临床经验。研究认为该病基本病机离不开阳虚水泛[1-3]，临床报道温阳化饮经方苓桂术甘汤对于改善肺心病右心衰患者心功能，缓解其临床症状体征等疗效确定[4-5]。本实验通过不同剂量苓桂术甘汤干预野百合碱所致肺动脉高压合并右心心力衰竭大鼠，探讨其疗效以及可能的作用机制。

1 实验材料与设备

1.1 实验动物

健康SD大鼠，9～10周龄，体质量200～250 g，购自成都达硕生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK(川)2015-030。大鼠饲养于SPF环境，温度：(23±3)℃，湿度：(55.5±10)%，大鼠可随意接触水源及饲料。

1.2 实验药物

苓桂术甘汤中所有生药购自四川新荷花中药饮片股份有限公司，所有药材均由GMP工厂生产，经新荷花检测中心检测合格。桂枝(批号：1608060)，茯苓(批号：1608027)，白术(批号：1609070)，甘草(批号：161109)。依照《金匮要略》[6]所著苓桂术甘汤药物配比，按人与大鼠等效剂量换算，实验共需茯苓321 g，桂枝238 g，白术238 g，生甘草166 g。依据《药典》[7]制剂制备要求，具体方法：药物浸泡60 min，采用合煎形式，第一煎加8倍水，第二煎加6倍水，严格控制煎煮时间；沸腾后，头煎用控温电炉保持微沸60 min，二煎保持微沸30 min，合并两次煎液，脱脂棉过滤，浓缩至200%浓度，使1 mL含原药材2 g；加入苯甲酸钠，每1 000 mL药液含苯甲酸钠3 g，揽匀，装入清洁药瓶中，4℃保存备用。呋塞米(江苏亚邦爱普森药业有限公司，批号：1301017)。野百合碱(上海麦克林生化科技有限公司，批号：C804263),1 g野百合碱用5 mol/L盐酸溶液充分溶解，10 mol/L氢氧化钠中和，PH值调整为7.2，加入生理盐水，调整为终浓度 20 mg/mL的野百合碱溶液。戊巴比妥钠(美国Sigma公司，批号：P3761),3 g戊巴比妥钠加入100 mL生理盐水稀释成 3%溶液。

1.3 主要试剂与仪器

苏木素伊红(HE)染色试剂盒(Beyotime Biotechnology公司，货号：C0105)；肾素(Renin)ELISA试剂盒(货号：F16722)，血管紧张素2(Angiotensin 2)ELISA试剂盒(货号： F15050)，抗利尿激素(AVP)ELISA试剂盒(货号：F15071)，心房钠尿肽(BNP)ELISA试剂盒(货号：F00231)，BCA蛋白定量试剂盒(货号：WB101)，改良Western及IP细胞裂解液(货号：WB007)均购自上海西唐生物科技有限公司；NF-κB抗体(货号：ab32360)，TNF-α抗体(货号：ab6671)均购自Abcam公司；内参抗体GAPDH(货号：5G4)购自HyTest Ltd公司；羊抗兔HRP标记二抗(货号：111-035-003)，羊抗鼠HRP标记二抗(货号：115-035-003)均购自Jackson公司；底物发光液(货号：WBKLS0500)购自Millipore公司。

彩色多普勒超声显像仪(GE公司，型号：Vivid E9)；酶标仪(Thermo公司，型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK3)；石蜡包埋机(德国徕卡公司，型号：EG1150C)；石蜡切片机(德国徕卡公司,型号：RM2235)；脱水机(德国徕卡公司,型号：ASP300S)；自动染色机(德国徕卡公司,型号：AutoStainer XL)；显微镜(日本奥林巴斯公司,型号：BX53)；摄像头(日本奥林巴斯公司,型号：DP27)；Clinx ChemiScope系列荧光及化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司,型号：6000)。

2 实验方法

2.1 实验分组及干预

60只SD大鼠适应性喂养1周后，随机抽取12只作为空白对照组，余均采用野百合碱腹腔注射制备慢性心力衰竭模型[8-9]。大鼠腹腔注射野百合碱溶液60 mg/kg，42 d后超声心动图检查造模成功[10]，将造模成功大鼠随机平均分为模型组，苓桂术甘汤高、低剂量组和呋塞米组。苓桂术甘汤高、低剂量组给药剂量分别为12 g/(kg·d)和2.5 g/(kg·d)，呋塞米组为20 mg/(kg·d)，各组均以5 mL/(kg·d) 蒸馏水稀释灌胃，模型组和空白对照组以等容量蒸馏水灌胃，1次/d，连续灌胃4周。

2.2 观测指标及方法

2.2.1 一般情况

从造模开始后监测大鼠死亡情况，精神状态、活动情况、皮毛情况以及饮食情况[8]。

2.2.2 心脏彩超及肺动脉压力检测

腹腔注射戊巴比妥钠0.25 mL/100 g麻醉后，行大鼠心脏及肺动脉彩色多普勒超声检查，超声测量舒张末期容积(EDV)、右室内径(RV)、右房内径(RA)；肺动脉压力、肺动脉压力与速度比值，肺动脉血流加速时间和肺动脉血流加速时间与射血时间比值。每组数据取连续3个心动周期的平均值[10]。

2.2.3 血浆脑钠肽、肾素、血管紧张素Ⅱ和抗利尿激素水平

采用ELISA法检测，按照试剂盒说明书操作。

2.2.4 心脏系数

解剖大鼠取心脏组织，计算心脏系数，心脏系数=心脏质量/体质量。

2.2.5 心脏组织HE染色

取出心脏置于冷生理盐水中短暂浸泡，清洗，取同部位心室肌组织放入3%戊二醛溶液标本瓶中预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，包埋，切片，HE染色，光学显微镜观察(×200)，每张切片不同倍数下随机选取1个视野进行图像采集[11]。

2.2.6 心脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白检测

心脏组织冻存于液氮中，后经裂解，BCA蛋白定量后，经电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显影过程，Western blot法检测蛋白NF-κB、TNF-α表达[12]。

2.3 统计方法

3 实验结果

3.1 大鼠一般情况

空白对照组大鼠精神佳，活动正常，食欲良好，体重正常，毛色有光泽。模型组大鼠一般情况较差，食欲下降，精神差，被毛稀疏。呋塞米组一般情况尚可，精神状态较模型组好，被毛稍稀疏。苓桂术甘汤高、低剂量组一般情况与呋塞米组近似，被毛光泽度较好。实验期间，模型组死亡6例，呋塞米组死亡2例，苓桂术甘汤高、低剂量组分别死亡5和4只。死亡比例较高主要原因为行心脏彩超检测时戊巴比妥钠麻醉过量致死。

3.2 大鼠心脏指数

模型组大鼠心脏重量指数较其他组稍有升高趋势，但差异不具有统计学意义(P>0.05),其余各组差异不明显(见表1)。

表1 各组大鼠心脏指数

3.3 大鼠心脏组织病理

空白对照组心肌细胞及周围组织形态均未见异常；模型组大部分心肌纤维出现自溶，肌纤维断裂、卷曲、排列紊乱，心肌细胞核固缩明显，甚至破裂消失，大部分在心包膜下周围细胞、心肌束等有淋巴细胞、巨噬细胞浸润；呋塞米组和苓桂术甘汤低、高剂量组均较模型组组织病变改善，其中苓桂术甘汤高剂量组改善效果更为显著(见图1)。

空白对照组(HE,×200) 模型组(HE,×200) 呋塞米组(HE,×200)苓桂术甘汤高剂量组(HE,×200) 苓桂术甘汤低剂量组(HE,×200)图1 各组大鼠心脏组织HE染色情况

3.4 大鼠肺动脉压力

与空白对照组比较，模型组肺动脉压力(p)和肺动脉压力与速度比值(p/v)升高；与模型组比较，呋塞米和苓桂术甘汤低、高剂量组p均降低(P<0.05)；与空白对照组比较，模型组肺动脉血流加速时间(PAAT)和加速时间与射血时间比值(PAAT/ET)降低，与模型组比较，呋塞米和苓桂术甘汤高、低剂量组PAAT升高(P<0.05)，差异有统计学意义(见表2)。

3.5 大鼠心功能

与空白对照组比较，模型组右心室和右心房内径，左心室舒张末期容积增大(P<0.05)，经呋塞米干预后，右心室和右心房内径，左心室舒张末期容积均降低(P<0.05)，苓桂术甘汤高剂量组降低右心室直径和舒张末期容积(P<0.05)，差异有统计学意义(见表3)。

3.6 大鼠血清脑钠肽(BNP)、抗利尿激素(AVP)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、肾素(REN)水平

与空白对照组比较，模型组BNP、AVP、REN和AngⅡ水平均增高,其中AVP、REN和AngⅡ增高差异具有统计学意义(P<0.05)，而经呋塞米和苓桂术甘汤各剂量组干预后均不同程度降低(P<0.05)(见表4)。

表2 各组大鼠肺动脉压力情况

表3 各组大鼠右心功能情况

表4 各组大鼠BNP、AVP、Renin、AngⅡ水平

3.7 大鼠心脏组织NF-κB、TNF-α蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组大鼠心脏组织NF-κB和TNF-α蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组比较，苓桂术甘汤高剂量组NF-κB和 TNF-α蛋白表达降低(P<0.05)，苓桂术甘汤低剂量组TNF-α蛋白降低(P<0.05)，呋塞米组NF-κB蛋白表达降低(P<0.05)，差异有统计学意义(见表5)。各组大鼠心脏组织中NF-κB、TNF-α蛋白电泳图见图2。

表5 各组大鼠心组织NF-κB、TNF-α蛋白表达情况

图2 各组大鼠心脏组织NF-κB、TNF-α蛋白电泳图

4 讨论

慢性肺源性心脏病合并心衰与多种因素引起的肺动脉高压直接相关，肺动脉高压使右心衰负荷加重，最终引起右心室扩大以及右心功能衰竭。血流动力学异常是心衰症状的病理生理改变，心室重构是心衰发生发展的基本病理机制，而神经内分泌细胞因子系统的过度激活是导致的心室重塑病理生理学基础。本研究即以野百合碱诱导的肺动脉高压合并右心衰为动物模型，模型组大鼠肺动脉压力和肺动脉压力与速度比值显著升高，同时肺动脉血流加速时间和加速时间与射血时间比值显著降低，BNP水平增高，右心室扩张，RAAS系统激活，模型建立成功。

依据临床表现，该类病证应归于“心水”“支饮”等“饮证”范畴来论治。根据《金匮要略》中相关条文的认识和理解，阳虚水饮贯穿于“饮证”发展的始终，本病主要病机为阳虚水停，心阳不振，脉行迟缓，脾阳衰弱，水液运行失职、肾阳不足，蒸腾气化无力，导致水饮停留，出现咳喘、心悸、胸闷、水肿等似“支饮”的表现。而温阳化饮法是治疗阳虚水停的基本大法，苓桂术甘汤是该治法的经方，方中桂枝和茯苓配伍，乃通阳利水的常用药对，桂枝与甘草药对协助助阳，茯苓与白术药对协助健脾制水，临床报道用于肺源性心衰治疗已取得确定疗效[13-14]。本次实验结果证实，肺动脉高压合并右心衰大鼠经苓桂术甘汤干预后，肺动脉压力和肺动脉压力与速度比值显著降低，同时肺动脉血流加速时间和加速时间与射血时间比值显著升高，BNP以及RAAS系统水平下调。其中以高剂量组调节作用更为显著，与呋塞米作用水平近似，而后者虽对于心衰利水作用明显，但不能长期服用，易致水液电解质紊乱。苓桂术甘汤临床常与葶苈大枣泻肺汤合用以温阳消饮、泄肺逐水，更甚者可与十枣汤合用峻下逐水，增强疗效。

炎症因子可诱导心肌细胞肥大、凋亡，其中TNF-α是细胞因子网络的关键因子[15]，在慢性心衰时TNF-α合成分泌增多，并激活NF-κB使其转入胞核内，进一步激活系列炎症、生长以及凋亡等基因的表达[12,16]。本研究由野百合碱诱导的大鼠右心心衰模型，TNF-α和NF-κB蛋白水平均显著升高，而经呋塞米和苓桂术甘汤干预后均显著下调。表明苓桂术甘汤可通过NF-κB 介导的细胞因子发挥温阳消饮的作用，进而干预肺源性右心衰的病理过程。

综上所述，高剂量的苓桂术甘汤可以改善野百合碱致肺动脉高压合并右心衰大鼠心功能及心脏病理，并可下调激活的RAAS系统和BNP水平，作用机制与下调NF-κB介导的细胞因子调控作用有关。