Pin1和mTOR在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤中的表达及临床意义

孙文秀

（凌源市中心医院耳鼻喉科，辽宁 朝阳122500）

鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤（NIP）是耳鼻喉科常见的临床上常见的一种良性肿瘤，中年男性为高发群体，发病率仅次于鼻部血管瘤，在鼻腔肿瘤中约占5%[1]。NIP病理特点表现为表层上皮呈分支状或乳头状过度增生，其细胞增殖的活性水平较高[2]。NIP具有恶性肿瘤的侵袭性及破坏性行为，极易复发或恶变为癌症，因此，又被归属于交界性肿瘤，即癌前病变，且多恶变为鳞状细胞癌[3]。随着鼻内镜手术技术的不断提高，NIP的治愈率也明显提高，但其复发及恶变率仍较高[4]。肽基脯氨酰异构酶1（Pin1）是一种具有特异性功能的高度保守蛋白，主要调节有丝分裂相关蛋白酶[5]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一种高度封闭的蛋白激酶，可调节细胞代谢[6]。Pin1和mTOR在肿瘤的发生及发展过程中的具有重要作用，但关于Pin1和mTOR在NIP表达的研究目前尚无相关报道，本研究旨在检测Pin1和mTOR在NIP组织中的表达情况，以探讨Pin1与mTOR表达的关系及其在NIP恶变中的作用，以期为NIP诊断治疗和预后提供新的理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年4至2018年6月本院收治的NIP患者（NIP组，n=81）和同期正常下鼻甲黏膜患者（正常下鼻甲黏膜组，n=60）作为研究对象。NIP组男59例，女22例；年龄40～75岁，平均年龄（57.36±7.49）岁。正常下鼻甲黏膜组男42例，女18例；年龄40～78岁，平均年龄（57.85±7.58）岁。两组临床资料比较差异无统计学意义，具有可比性。所有患者均对本研究知情同意，并自愿签署知情同意书。本研究已通过医院伦理委员会审核批准。纳入标准：①符合NIP诊断标准并确诊[7]；②患者年龄＞18岁；③签署知情同意书。排除标准：①既往存在慢性鼻鼻窦炎病史者；②既往存在变态反应病史者。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 主要仪器：切片机（德国LEICA公司）、光学显微镜（日本Olympus公司）、低温冰箱（韩电公司）、恒温箱（武汉医疗仪器厂）；主要试剂：鼠抗人Pin1克隆抗体（青岛捷世康生物科技有限公司）、鼠抗人mTOR单克隆抗体[微蒙（上海）生物科技有限公司）、浓缩型兔抗人CyclinD1单克隆抗体、DBA试剂盒及S-P超敏免疫组化试剂盒均由上海万疆生物技术有限公司提供。

1.2.2 检测Pin1和mTOR蛋白表达 采用免疫组织化学方法检测病理组织标本中Pin1和mTOR蛋白表达，采用切片机将石蜡包埋组织切成4 μm厚度，并置入60℃恒温箱烤片30 min，取出自然冷却晾置30 min，二甲苯脱蜡（40 min）后，依次放入100%、95%、80%及75%的乙醇中各10 min，PBS洗涤3次（每次5 min），蒸馏水浸泡5 min后加入3%过氧化氢溶液50 μL，在恒温箱（20℃）孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活，PBS冲洗3次（每次5 min），加入50 μL的一抗（1:100）过夜（4℃），加入二抗孵育10 min（20℃），采用DBA试剂盒中的试剂进行显色，放入显微镜下观察，显色后用蒸馏水洗掉，终止显色，苏木素复染2 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 观察指标及评价标准Pin1蛋白及mTOR蛋白显色后，呈黄色或棕黄色则为阳性。随机抽取每张切片的10个视野（×400），按阳性细胞所占的百分率和着色深浅进行结果判定。阳性细胞百分比评分（PP）标准：①0分，阳细胞＜25%；②1分，25%≤阳性细胞百分比≤50%；③2分，50%＜阳性细胞百分比≤75%；④3分，阳性细胞百分比＞75%。染色强度评分（SI）标准：①0分，无染色；②1分，淡黄色；②2分，棕黄色；③3分，棕褐色。按照公式：免疫反应评分（IRS）=PP×SI，并将IRS＞1分判断为阳性表达[8]。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计数资料用[n（%）]表示，比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Pin1和mTOR蛋白表达情况比较NIP组Pin1和mTOR蛋白阳性表达率分别为72.84%、79.01%，均明显高于正常下鼻甲黏膜组表达率（1.67%、6.67%），差异均有统计学意义（P＜0.05）；Pin1蛋白主要在细胞核中表达，呈黄色至棕色，mTOR蛋白主要在胞浆中表达，呈黄色至棕褐色，见表1、图1。

表1 两组Pin1和mTOR蛋白表达情况比较[n（%）]Table 1 Comparison of Pin1 and mTOR protein expression between the two groups[n(%)]

图1 Pin1和mTOR蛋白表达情况Figure 1 Protein expression of Pin1 and mTOR

2.2 Pin1和mTOR蛋白在NIP中表达的相关性分析 经Spearman相关性分析显示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表达呈正相关性（r=0.624，P=0.000）。

3 讨论

NIP是常见的鼻腔鼻窦的良性肿瘤，在所有鼻部乳头状瘤中约占75%[9]。目前NIP的发病机制尚未明确，通常认为人类乳头状瘤病毒（HPV）感染是NIP发病的主要原因之一，尤其是高危型HPV与其复发及恶化密切相关，此外变态反应、慢性炎症、环境因素等也是高危影响因素[10]。NIP具有特殊的临床特点及病理学特征，即对周围组织结构具有局部侵袭性，多中心生长及转移，且发展迅速，少数伴有恶变倾向，因此，局部交界性肿瘤的特点[11]。目前对于NIP恶变的机制尚未明确，需进一步深入研究。随着肿瘤分子生物学的不断发展，肿瘤相关的因子指标对NIP的发生、发展和预后有着重要的指导意义。

Pin1于20世纪90年代首次被发现，属于多肤基脯氨酸顺反同分异构酶家族，直接影响蛋白功能活性，对细胞的有丝分裂具有重要调节作用[12]。相关研究显示[13]，Pin1在多种恶性肿瘤中，尤其在鳞癌中存在过表达，并对肿瘤的发生及发展起重要作用。Pin1会激活JNK活化c-jun及协同Ras信号传导通路，从而促进CyclinD1的转录，且阻止Cyc11nD1从胞核移至胞浆降解，进而使细胞周期紊乱，导致肿瘤发生，且敲除Pin1后，会导致癌细胞凋亡[14]。本研究结果显示，NIP组Pin1蛋白阳性率高于正常下鼻甲黏膜组（P＜0.05），原因为正常状态下，Pin1通常呈低表达，当细胞恶变后，其表达上调，并导致细胞周期发生紊乱，细胞增殖速度加快，促使肿瘤的发生发展。在NIP中Pin1参与肿瘤细胞的有丝分裂，并可能造成细胞周期出现紊乱，肿瘤细胞增殖加速，恶变风险增高。

mTOR最早在20世纪90年代初被发现，属于磷酸肌醇3-激酶相关蛋白激酶家族成员，是一种位于PI3K/PKB信号蛋白通路下游的靶蛋白[15]。相关研究证实[16]，mTOR在多种恶性肿瘤细胞中存在异常表达，与肿瘤的发生发展密切相关，直接或间接控制细胞的生长、增殖及迁移等生物过程。本研究结果显示，NIP组mTOR蛋白阳性率高于正常下鼻甲黏膜组（P＜0.05），这可能是因为mTOR的过度表达会上调CyclinDl蛋白的表达，从而导致细胞生长周期发生紊乱，并可加速细胞的恶变。

本研究结果显示，在NIP中Pin1和mTOR蛋白表达呈正相关性，原因为Pin1具有调节细胞有丝分裂的功能，可与大部分酶类产生相互作用，加快细胞的转化与增殖[17]。mTOR属于一种不典型蛋白激酶，参与细胞增殖、迁移和细胞周期调控，调控细胞生长调节的核心歩骤，可与Pin1产生相互作用，在细胞周期中对细胞生长有重要作用，且两者有一个共同的下游底物，即CyclinDl，从而在肿瘤形成过程中发挥重要作用，并可能是恶性细胞发生的重要因素，在NIP发生恶变的过程中起重要作用[18]。

综上所述，Pin1和mTOR蛋白在NIP中高表达，通过有效抑制两者的过表达，可能有望成为NIP靶点治疗的新方向。