基于生物信息学方法分析颈动脉粥样硬化的关键通路和枢纽基因

李先芳，林璋

（福建省老年医院心血管内科，福建 福州350000）

颈动脉粥样硬化是心脑血管疾病发生的主要因素，明确颈动脉粥样硬化的发病机制是预防心脑血管的关键[1-3]，尽管影响颈动脉粥样硬化的相关因素较多，但目前颈动脉粥样硬化的分子机制尚未完全明确，因此，研究颈动脉粥样硬化的分子机制具有重要意义。随着测序技术的发展及公共数据库的建立，利用生物信息学探索疾病的相关机制越来越普遍[4]。本研究利用生物信息学和GEO公共数据库进行分析，获得颈动脉斑块与斑块旁组织的差异基因（differentially expressed genes，DEGs)，并利用GO和KEGG对差异基因进行富集分析，同时利用PPI网络和cytoscape技术筛选差异基因的枢纽基因，探索经颈动脉粥样硬化潜在的治疗靶点，为心脑血管疾病的早期预警奠定一定的理论基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 差异基因的筛选 在GEO数据库分析GSE43292数据集，该数据集含有32例颈动脉粥样斑块组织和32例斑块旁组织，利用GEO2R在线工具分析获得DEGs，利用R语言进行火山图绘制。

1.2 GO和KEGG分析GO富集分析是按照生物学进程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组分（cellular component，CC）进行富集调查的方法，对基因功能进行注解；KEGG是将基因按照所在生物学通路进行富集分析。利用R语言包clusterprofile对DEGs进行GO和KEGG分析。

1.3 蛋白互作网络构建和枢纽基因的筛选 蛋白互作（proetin-protein interaciton，PPI）网络是用于预测和分析蛋白之间的潜在相互作用，利用STRING在线数据库构建PPI网络（https://string-db.org/cgi/input.pl），将蛋白互作网络导入cytoscape软件，利用cytohubba筛选枢纽基因。

2 结果

利用GEO2R分析GSE43292共获得97个DEGs，包括46个上调DEGs和51个下调DEGs，所获结果可视化为火山图，见图1。

图1 GSE43292的火山图Figure 1 Volcano map of GSE43292

2.1 差异表达基因的GO功能富集及KEGG通路分析 利用R语言对97个DEGs进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，按富集基因数目排序，分别取位于前10的分析结果。GO功能注释结果显示：在生物学过程中，DEGs主要涉及细胞外结构组织、平滑肌细胞增殖的负调控、吲哚烷基胺代谢过程等，见图2；在细胞组分中，DEGs主要与细胞外基质、受体复合物和细胞膜面有关，见图3；在分子功能上，DEGs主要涉及碳水化合物结合、酰胺键、金属内肽酶活性等。KEGG通路分析显示，DEGs主要富集cAMP信号通路、色氨酸代谢、PPAR信号通路等相关通路，见图4～5。

图2 差异基因的GO注释功能生物学过程分析Figure 2 The biological process of GO analysis

图3 差异基因的GO注释功能细胞组分分析Figure 3 The cellular component of GO analysis

图4 差异基因的GO注释功能分子功能分析Figure 4 The molecular function of GO analysis

图5 差异基因的KEGG富集通路分析Figure 5 KEGG pathway analysis

2.3 PPl网络构建及枢纽基因建立 将97个DEGs的String蛋白互作分析结果导入Cytoscape进行可视化，见图6，然后在MCODE插件中找出得分最高的蛋白互作模块，最后在cytoHubba插件中利用MCC法筛选MMP9、CXCL10、CD163和CCR1等5个枢纽基因，见图6。

图6 差异基因PPI网络图Figure 6 PPI netwolk of DEGs

3 讨论

本研究利用生物信息学分析技术对颈动脉斑块组织和斑块旁组织进行分析，共获得97个DEGs，其中上调基因46个，下调基因51个。DEGs可能与颈动脉斑块的发生和发展相关[5-6]。KEGG基因富集分析发现颈动脉粥样硬化的发生、发展可能与cAMP信号通路、色氨酸代谢、PPAR信号通路等有关[7]。PPI网络分析筛选出CD163、MMP9、CXCL10、CCR1为枢纽基因，可能在动脉粥样斑块进展中发挥重要的作用[8-9]。

CD163为清道夫受体半胱氨酸富集结构域家族成员，其通常在单核巨噬细胞膜上表达，通过调控炎症因子的表达而发挥抗炎、抗氧化作用，与清道夫的功能相关[10-11]。而清道夫是与颈动脉斑块的危险因素。MMP9属于基质金属蛋白酶家族，是一种基质溶解素。大量研究表明，血清MMP-9与颈动脉粥样硬化性斑块形成及其稳定性密切相关[12-13]。动脉粥样硬化初期，激活的血管内皮细胞表达CXCL10粘附分子，发挥粘性趋化炎性细胞的渗入，随着血小板的转移，炎性细胞随之渗入血管壁和血管平滑肌细胞，所以在动脉粥样硬化中至关重要[14-15]。迄今为止，动脉粥样硬化的潜在机制未完全清楚，但其重要环节中均发现炎性细胞的局部浸润及CXCL10的表达量增加[16-17]。CCR1即趋化因子C-C基元受体1，该基因编码β趋化因子受体家族的成员，此受体有7个跨膜区，而其与正常T淋巴细胞的分泌、单核细胞趋化蛋白3（MCP3）以及骨髓祖细胞抑制因子-1（MPIF）均有关，影响巨噬细胞的功能[18]。

综上所述，本研究通过生物信息学方法分析颈动脉粥样硬化斑块的相关通路变化，为颈动脉斑块发生机制研究奠定基础，本研究筛选的枢纽基因，可能成为颈动脉粥样硬化斑块的潜在治疗靶点。