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鱼藤酮对PC12细胞及大鼠脑线粒体的损伤作用

2021-06-02刘雨周青李晓秀刘波

沈阳医学院学报 2021年3期
关键词:膜电位缓冲液存活率

刘雨,周青,李晓秀,刘波

(1.沈阳医学院药学院2017级药学专业,辽宁 沈阳110034;2.基础医学院2015级医学影像学专业;3.沈阳医学院药学院;4.辽宁省行为与认知神经科学重点实验室)

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一种神经退行性疾病,多发生于老年人,主要症状包括静止性震颤、肌僵直、运动功能和姿势平衡障碍。典型的病理特征为黑质多巴胺(dopamine,DA)神经元大量缺失,且有路易小体异常折叠聚集。PD的病因和发病机制尚不明确,目前认为可能与遗传基因、老龄化、经常接触或暴露于环境污染物,比如杀虫剂鱼藤酮等各种危险因素相关[1]。现有的药物仅可以缓解症状,不能终止或逆转疾病进程。故建立简便有效的PD模型对于开展病因、发病机制、药物筛选研究具有重大意义。本研究旨在细胞、脑组织水平,探讨鱼藤酮对线粒体的影响,为建立鱼藤酮诱导的PD模型提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及实验动物 PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)购自中国医学科学院基础所。清洁级SD雄性大鼠,6只,体重280~300 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证号:SCXK(京)2006-0009。

1.2 试剂与仪器 RMPI 1640培养基(美国Gibco公司),标准胎牛血清(FBS)、马血清(美国HyClone公司);鱼藤酮、DCFH-DA、多聚赖氨酸、ADP(美国Sigma公司);ATP检测试剂盒(美国Promega公司);CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) (碧云天生物技术研究所);其他常用化学试剂均为分析纯。细胞培养箱(日本三洋公司),正置显微镜(OLYMPUS-IX62),超净工作台(北京半导体设备一厂),AllegraTM X-22R低温离心机(美国Beckman公司),Spectra Max M5酶标仪(美国Molecular Devices公司),线粒体氧耗测定仪(英国SI公司)。

1.3 方法

1.3.1 PC12细胞的培养 将PC12细胞以完全RMPI 1640培养基(含10%灭活马血清,5%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,1%谷氨酰胺),于37℃、5%CO2、饱和湿度、无菌条件下培养,每2 d换培养基一次,细胞呈对数增长时,进行细胞传代。取对数生长期的细胞,以完全培养基调整细胞浓度至3.4×104个/孔,接种至96孔培养板,置入细胞培养箱孵育24 h。制备模型时,正常对照组换用4%血清培养。

1.3.2 CCK-8试剂测定细胞活力 将不同浓度(0.1、1、2、5μM)鱼藤酮处理24、48、72 h后,加入CCK-8试剂,10μl/孔,37℃孵育2 h,450 nm处读取吸收值。以正常对照组细胞存活率为100%,计算各组细胞存活率。

1.3.3 DCFH-DA荧光探针测定细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量 将2μM鱼藤酮处理5 h后,弃原液,PBS洗一次,加入含DCFH-DA(终浓度10μM),100μl/孔;37℃孵育20 min,弃染料,PBS洗一次,每孔加入100μl PBS。在激发波长488 nm,发射波长525 nm下测定荧光值。以对照组ROS含量为100%,计算各组细胞ROS含量。

1.3.4 荧光素酶发光法测定细胞内ATP含量 使用CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay(promega G7570),将2μM鱼藤酮处理48 h后,室温放置30 min,加入100μl发光试剂,振荡混匀2 min以诱导细胞裂解,室温避光放置10 min以稳定发光信号,使用M5酶标仪检测ATP含量。以对照组ATP含量为100%,计算各组细胞ATP含量。

1.3.5 JC-1荧光探针测定线粒体膜电位(△Ψm) 将细胞接种24孔板,2μM鱼藤酮作用48 h后,弃原液,PBS轻吹、离心、收集细胞。加入JC-1染色工作液,充分混匀,细胞培养箱中37℃孵育20 min,用染色缓冲液洗涤2次。重悬后分别加入96孔板,测定荧光值。检测JC-1单体时,激发光波长490 nm,发射光波长530 nm;检测JC-1聚合物时,激发光波长525 nm,发射光波长590 nm。

1.3.6 大鼠脑线粒体提取 大鼠断头处死后,迅速取出脑组织,去除小脑,称重。置于预冷的玻璃甁皿内,用预冷的线粒体分离缓冲液(0.25 M glucose、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、250μg/ml BSA,调节pH 7.4)冲洗3次,剥去血管,去除淤血,剪成碎块,转入玻璃匀浆器,加入分离缓冲液(10 ml/g组织),手动匀浆10次。所得匀浆液以700 g离心10 min,取上清;将上清以10 000 g离心10 min,去除上清,所得沉淀即为线粒体;以分离缓冲液重悬沉淀,10 000 g重复离心10 min,弃上清,将线粒体沉淀悬于300μl分离缓冲液中。以Bradford方法检测线粒体蛋白浓度。线粒体制备过程均在4℃环境下进行。

1.3.7 Clark氧电极法测定线粒体呼吸功能 反应温度30℃,反应总体积1.0 ml。调节氧电极,校正100%氧(连续搅拌30 min)和0%氧(向反应体系加入亚硫酸钠,将氧气全部消耗)。向反应池加入线粒体呼吸缓冲液920μl(225 mM glucose、5 mM KH2PO4、10 mM Tris-HCl、10 mM KCl、0.2 mM EDTA、100μg/ml BSA,调节pH 7.4),稳定1 min,依次加入线粒体悬液40μl(终浓度0.5 mg/ml)、鱼藤酮10μl(终浓度分别为1、0.1、0.01μM)、底物I共10μl(L-谷氨酸钠及苹果酸),出现Ⅱ态呼吸;加入20μl ADP(终浓度250μM),出现Ⅲ态呼吸;反应足够长时间,进入Ⅳ态呼吸。再次加入ADP,出现新的Ⅲ态和Ⅳ态呼吸。观察并记录氧耗曲线,计算线粒体氧化磷酸化参数:Ⅲ态呼吸速率(V3)、Ⅳ态呼吸速率(V4)、呼吸控制指数(respiration control rate,RCR)。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,结果以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鱼藤酮对PC12细胞存活率的影响 与对照组比较,PC12细胞经不同浓度的鱼藤酮处理24、48、72 h,细胞存活率呈不同程度的下降(P<0.05)。其中,2μM的鱼藤酮与PC12细胞共处理48 h,细胞活力下降为对照组的47.57%。见图1。

图1 鱼藤酮对PC12细胞存活率的影响

2.2 鱼藤酮对PC12细胞ROS、ATP含量、线粒体膜电位的影响 与对照组比较,经2μM鱼藤酮处理5 h后,PC12细胞的ROS含量显著升高;2 μM鱼藤酮处理48 h后,细胞ATP含量显著降低;线粒体膜电位显著降低(P<0.05),见表1。

表1 鱼藤酮对PC12细胞ROS、ATP含量、线粒体膜电位的影响

2.3 鱼藤酮对大鼠脑线粒体呼吸功能的影响 与对照组比较,鱼藤酮使线粒体氧化磷酸功能呈剂量依赖性损伤,呼吸效率下降,表现为模型组线粒体的V3、V4、RCR显著降低(P<0.05),见图2。

3 讨论

PD的病因尚不明确,可能与年龄老化、家族遗传、环境等因素有关。近年来,研究显示,许多环境化合物参与了线粒体功能障碍、氧化应激、小胶质细胞活化及α-突触核蛋白异常聚集以及自噬受损等发病机制,从而增加了PD的发生风险。鱼藤酮曾作为杀虫剂广泛应用,具有亲脂性,可透过血脑屏障。流行病学研究发现,长期接触鱼藤酮的人群患PD概率增加[2-3],体内外研究结果表明,鱼藤酮可导致中枢DA神经元损伤,神经细胞内出现路易小体,动物出现震颤、步态不稳等PD症状[4-5]。研究发现线粒体在鱼藤酮所致的多巴胺神经元变性损伤中发挥了核心作用,线粒体的功能障碍参与了鱼藤酮诱导的DA能神经元的变性损伤和PD的病程[6]。

图2 鱼藤酮对大鼠脑线粒体呼吸功能的影响

PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,在形态和功能上具有典型的神经细胞特征。PC12细胞表达多巴胺转运体,并合成多巴胺,细胞膜上的受体及合成的递质接近中脑DA能神经元,故广泛应用于神经元,特别是DA能神经元死亡方式的研究,是研究体外神经细胞损伤及保护最为广泛的细胞系,常用于PD的研究。

本研究选用PC12细胞建立体外PD模型,首先以不同浓度的鱼藤酮与细胞共处理,细胞存活率呈不同程度下降,最佳的处理浓度和时间是2μM和48 h,此时细胞的存活率是47.57%。在明确了损伤条件后,进一步探讨了鱼藤酮损伤PC12细胞的作用机制。以往研究表明,鱼藤酮与线粒体具有较高亲和力,能够选择性抑制线粒体复合物I,进而影响线粒体功能和细胞存活[7]。线粒体膜电位的缺失在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用,本研究应用荧光探针JC-1指示线粒体膜电位水平,围绕线粒体功能,考察了2μM鱼藤酮对多巴胺神经细胞线粒体的膜电位及能量代谢的影响。结果显示,鱼藤酮显著降低线粒体膜电位和ATP含量。线粒体膜电位是反映线粒体功能的重要指标,膜电位的改变影响质子泵功能,进而影响ATP的生成。近年来,线粒体功能障碍与氧化应激在PD病理机制研究中备受关注。线粒体是细胞内氧自由基的主要来源。线粒体消耗了细胞内85%~90%的氧,用以支持氧化磷酸化ATP合成,在这个过程中产生了大量的氧自由基。在生理状态下,ROS产生与清除可以达到动态平衡。但线粒体损伤时,平衡会被打破,大量的ROS攻击DNA、蛋白质、脂质,导致线粒体功能障碍,产生更多的氧自由基,造成恶性循环。通过检测细胞内ROS及ATP含量,可反映细胞氧化应激及能量代谢水平。在本研究中,鱼藤酮能够引起氧化应激,与以往报道[8]一致,本研究还发现,2μM鱼藤酮处理PC12细胞,ROS的含量显著升高的时间点为共孵育5 h,该时间点早于线粒体功能障碍的时间,故鱼藤酮引起的氧化应激可能是引起神经细胞损伤的重要途径。

线粒体是糖、脂肪和氨基酸最终氧化的场所。其主要功能是氧化磷酸化合成ATP,为生命活动提供能量,为了验证鱼藤酮对线粒体的直接影响,本研究以大鼠脑线粒体为研究对象,采用Clark氧电极法,直接测定鱼藤酮对线粒体呼吸功能的改变。在NADH呼吸链启动的条件下,与对照组相比,鱼藤酮组V3、V4、RCR均显著降低。RCR值可以反映线粒体的结构及功能的完整性,比值越大,表明线粒体结构越完整,而损伤的线粒体RCR值可低至1。研究结果验证了鱼藤酮直接损伤大鼠脑线粒体,使呼吸效率显著下降。

线粒体功能障碍是PD发病机制学说之一,以线粒体为靶点,筛选PD治疗药物已经成为一种新策略[9]。本研究表明鱼藤酮在细胞和脑组织水平可以不同程度的损伤线粒体,引起DA能神经元氧化应激及降低细胞存活率。该结果为建立鱼藤酮诱导的体外PD模型,深入研究PD病理机制、筛选候选药物,实现精准的靶向治疗提供了实验依据。

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