红细胞膜电位的光学测定方法

高文杰 朱自严上海市血液中心 200051

细胞膜电位(membrane potential)是指以细胞膜相隔的细胞质和细胞外液之间产生的电位差。通常认为这种跨膜电位主要来源于离子不对称性所致的扩散电位，而这种离子不对称性是通过主动泵以及不相同的离子通透性造成的。红细胞膜电位对维持红细胞正常的生理活动起着重要的作用，红细胞的膜电位随着年龄的增大其绝对值逐渐减小，许多疾病也反映在红细胞膜电位的变化上，例如疟原虫感染的红细胞膜电位绝对值比正常红细胞要增加2～3倍，因此膜电位的相关研究具有重大意义，所有这些研究都涉及1个如何测定膜电位的问题。测定细胞膜电位最常用的方法是利用微电极或者膜片钳技术直接进行测量，但是用膜片钳测量如此微小红细胞的跨膜电位是有一定困难的，而且这种方法费时费力，成本较高，不利于对红细胞膜电位及其变化做出快速的检测，现在越来越多的人用荧光光学技术测量红细胞膜电位。iBAC4(3)为最常用的膜电位荧光染料，它是1种带负电荷的阴离子慢反应染料。该染料本身无荧光，当其进入细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发出荧光，由于染料Di-BAC4(3)是一价的负离子，它在质膜2侧按照细胞膜电位分布，服从能斯特方程，膜电位可由下面的方程式估算:V=Edye=(其中V表示跨膜电位，R为气体常数、T为绝对温度、F为法拉第常数、Ci和Ce分别表示细胞内和细胞外的染料浓度)。流式细胞仪测得细胞内的荧光强度，同细胞吸收的染料的量成线性关系，由于红细胞大小体积相当，所以细胞内的荧光强度Fi与细胞内染料的浓度Ci成线性关系。同时被红细胞吸收的荧光染料相对红悬液中的染料来说可以忽略不计，即红细胞吸收染料后红悬液中的Ce保持不变。Ce对应的荧光强度Fe，可以通过固定细胞使其去极化从而使细胞内外染料浓度相同，即Ce=Ci，对其进行流式细胞仪的测定。因此细胞膜电位计算公式又可以表示为:V=Edye=。由此通过荧光强度Fi和Fe可以定量的推算出任意Ce溶液的细胞内的Ci，进而求细胞的膜电位V。我们由此方法测得红细胞膜电位为(-9±0.8)mv，很好的对应了膜片钳的测定结果，而且这种方法的灵敏度很高，一般细胞膜电位改变1 mv则对应的荧光值改变10%左右。此外，我们还对一些动物的红细胞进行了测定结果如下:比格犬(-9.45 mv)、食蟹猴(-9.99 mv)、亚洲黑熊(-12.27 mv)、C57小鼠(-12.31 mv)。用荧光光学技术测量红细胞膜电位也有一定的缺点，即只能测定一定数量的细胞膜电位的平均值，不能测定单个细胞的膜电位。