Semaphorin4D与血管生成拟态在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其意义＊

文/黄晓玲，石丽萍，张帝开，曾秀华，周明

1 研究背景

卵巢癌是妇科第二常见和致命的恶性肿瘤[1]。在卵巢癌中，上皮性卵巢癌几乎占90%，由于缺乏早期诊断的有效方法，常常在发现时已是广泛的肿瘤浸润、腹膜转移，导致治疗效果欠佳。Sema4D 又称 CD100，是一个跨膜糖蛋白，Sema4D 在肿瘤引起的血管生成中扮演类似血管内皮生长因子（VEGF）的角色，血管内皮生长因子是一种蛋白质，已被作为某些癌症治疗的一部分，而Sema4D 促进血管生成的具体机制如何，是否可以作为癌症诊断及治疗的一部分，尚不明确。

血管生成拟态（VM）是Maniotis 等提出的由肿瘤细胞本身形成的类血管样管道。VM 的存在使恶性肿瘤细胞与机体血循环直接接触,造成肿瘤细胞的侵袭能力增大，从而耐药性增强,最后会导致传统的抗肿瘤血管生成治疗难以彻底阻断肿瘤血供,影响患者生存率。

本研究主要希望通过检测Sema4D 及VM、MCV 在卵巢恶性肿瘤、卵巢良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达情况，并结合临床病理因素分析其意义，探讨Sema4D 在卵巢癌发生发展过程起怎样的作用，其影响是否与VM 及MCV 相关，Sema4D 蛋白与VM及MCV 的表达与临床因素间有何关系。

2 研究方法

本研究收集2014 年1 月—2019 年1 月罗湖区人民医院经手术和病理证实的33 例卵巢恶性上皮性肿瘤患者的肿瘤组织、38 例卵巢良性上皮性肿瘤组织。纳入标准：①均经病理学确诊为卵巢上皮性肿瘤者；②初次治疗及临床病理资料保存完整者；③无其他肿瘤者；④术前未做放化疗者。恶性肿瘤组患者年龄21 ～70 岁，其中＜50 岁者18 例，≥50 岁者15 例。病理分型：浆液性腺癌20 例，黏液性腺癌8 例，子宫内膜样癌5 例。根据2014年FIGO手术病理分期对恶性肿瘤患者进行分期：Ⅰ期23例，Ⅱ期2 例，Ⅲ期6 例，Ⅳ期2 例；良性肿瘤组患者年龄19~80 岁，＜50 岁者32 例，≥50 岁者6 例，病理分型：浆液性腺瘤20 例，黏液性腺瘤18 例。所使用标本均经患者知情并同意，研究经罗湖区人民医院伦理委员会批准。

通过免疫组织化学染色（法）检测卵巢组织包括恶性肿瘤、良性肿瘤及正常卵巢组织中Sema4D 蛋白表达，由两位经验丰富的病理科医师，采用双盲法在高倍视野下（400X）对免疫组织化学染色结果进行判断，研究因子的阳性表达水平由染色强度评分和阳性细胞数百分比评分的乘积表示。染色强度为无色、淡黄色、棕黄色和棕褐色，分别取0~3 分；高倍视野下观察到的目的因子阳性表达细胞数占总细胞数的百分比：10%取0 分、10%~50%取1 分、50%~75%取2 分、＞75%取3 分。本实验阳性表达水平标准为：0~3 分为免疫反应阴性，＞3 分为免疫反应阳性。

对所有标本组织进行PAS 糖原染色和CD31 免疫组织化学染色双重染色，判断血管生成拟态。由两位研究者，采用双盲法判断结果。在肿瘤组织中，CD31 染色阳性的管道样结构为内皮血管；PAS 染色阳性但CD31 染色阴性的管道样结构为血管生成拟态管道，其内可含有血细胞，有相关结构为阳性，未见相关结构为阴性。

微血管密度（Microvessel Density，MVD）的测定：以CD31标记血管内皮细胞计数微血管数，每一标本低倍镜（100×）下选3 个微血管数最多的区域，在每一个区域中计数1 个高倍镜（400×）下的微血管数，取3 个视野的均值。

3 统计

采用SPSS13.0 软件对所得数据进行统计学分析，采用Fisher精确检验或卡方检验及t 检验比较临床病理变量与Sema4D、VM 或MVD 的相关性。用卡方检验分析Sema4D 与VM 之间的相关性，用t 检验及点双列分析Sema4D 与MVD 之间的相关性。

4 结果

Sema4D 在良性肿瘤组及恶性肿瘤组中的表达有明显差异，在恶性肿瘤组中有明显表达；VM 出现在良性肿瘤组及恶性肿瘤组之间的差异有统计学意义；恶性肿瘤组的MVD 较良性肿瘤组的MVD 明显较高，结果有统计学意义。（见表1）。在所有病例中分析，Sema4D 与VM 之间有相关性（见表2），考虑Sema4D 对VM 的形成有影响。Sema4D、VM 均与MVD 呈正相关关系（见表3），考虑Sema4D 有血管生成作用，符合既往研究结果，而VM阳性的病例中的MVD 较高，具体两者相关的原因仍需进一步研究。在恶性肿瘤内分析（见表4），Sema4D、VM 及MVD 均与肿瘤分化程度有关，3 者均与年龄及、是否淋巴结转移、肿瘤分期之间均无明显关系。

表1 良性肿瘤+恶性肿瘤

表2 良性肿瘤+恶性肿瘤

表3 良性肿瘤+恶性肿瘤

表4 恶性肿瘤组

5 讨论

Chen 等的研究提示Sema4D 可能是早期准确预测EOC 预后不良的可靠工具，对促进EOC 微环境中肿瘤的扩散和转移具有重要作用[2-3]。VM 是恶性肿瘤中一种特殊的血管形态，由高度侵袭性的肿瘤细胞构成。这种肿瘤细胞介导的血供模式与癌症患者预后不良密切相关。可以初步认为，Sema4D 的促进肿瘤发生发展的作用可能与VM 相关，其具体机制有待进一步研究证实。结合既往研究，对于VM 阳性病例，可能存在对抗血管生成不敏感或疗效不佳情况，具体情况如何有待进一步研究分析证实。本研究同时检测了肿瘤中的微血管数，提示Sema4D 与MVD 呈正相关关系，与既往结果相似。然而有趣的是，VM 与MVD 也呈正相关，3 者均与恶性肿瘤的分化程度有关，可见三者之间相关密切。Sema4D 可促血管生成早已证实，而Sema4D 可能同时存在有促VM 生成作用。