慢性阻塞性肺疾病患者Nrf2基因多态性与肺功能及临床病情判断的相关性研究

闫海燕，杨云秀，杨云华，宋晓伟，缑 剑

(1.咸阳市第一人民医院呼吸与危重症医学科,陕西咸阳 712000；2.陕西唐华四棉医院呼吸科，西安 710038；3.西安北车医院内科，西安 710085)

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以持续气流受限为特征的呼吸道疾病，呈进行性发展，严重影响患者生活质量，最终导致右心衰竭等严重后果[1-2]。报道发现COPD 已成为国内第四大死因[3]。目前，肺功能检查作为诊断COPD 的金标准已广泛用于临床，但研究显示COPD 临床病情还与全身效应有关[4-6]。核因子相关因子2（Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2）为转录因子家族成员，参与氧化应激过程[7]。有动物实验显示Nrf2介导的抗氧化作用可影响哮喘易感性[8]。但目前有关Nrf2 与COPD 的关系，临床研究尚属少见。本研究纳入78 例COPD 患者作为研究对象，探讨Nrf2 基因多态性在COPD 诊疗中的作用。报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 纳入2018年6月～2020年6月78例COPD 患者作为研究对象，其中男性48 例，女性30 例；年龄59.21±13.74 岁；体重指数20.18±2.32 kg/m2。纳入标准：①COPD 诊断符合中华医学会推荐指南标准[9]；②均在本院接受规范住院治疗；③患者均对研究内容知情同意，并签署知情同意书。

排除标准：①并发有肺结核、支气管扩张及肺源性心脏病者；②肝肾功能严重不全者；③并发有恶性肿瘤者；④对治疗药物过敏或未能顺利完成治疗者。

1.2 仪器和试剂 引物由美国Invitrogen 公司设计，PCR 酶由上海圣尔生物科技有限公司提供，illumina NovaSeq6000DNA 测序仪（上海士森视觉科技有限公司）。肺功能仪为Geratherm Spirostik Complete 型肺功能仪。

1.3 方法 采集清晨肘静脉血5ml，以酚-氯仿法提取基因组DNA，冷冻保存备用。参照文献设计引物：上游：5’-CCTAAAGGGGCTTCTCGG-3’，下游：5’-CGTTGCAATATCA-3’，PCR 片段长度262bp。扩增体系20μl，包括PCR Max 5.0μl，上下游引物各1.0μl，DNA 模板1.0μl，双蒸水12μl。反应条件：95 ℃预变性120s，90 ℃变性30s，50 ℃退火30s，72 ℃延伸45s，90 ℃变性45s，45℃退火30s，45 个循环。72℃延伸10min。PCR 扩增后，以1.5g/dl 琼脂糖凝胶确定是否扩张成功。用测序仪进行测序，并以直接测序法验证结果。

分别在治疗前和治疗后采用肺功能仪检测用力肺活量（forced vital capacity，FVC），一秒钟用力呼气量（forced expiratory volume in one second，FEV1%）及最大通气量（maximal ventilation volume，MVV）水平，计算FEV1/FVC。在治疗1 个疗程后评估疗效[10]。显效：临床症状明显好转，意识清晰，肺功能分级降低2 级及以上，无低氧血症；有效：临床症状缓解，意识清楚，肺功能分级降低1 级；无效：临床症状无明显改善。以（显效+有效）/总例数×100%计算总有效率。

1.4 统计学分析 选用SPSS24.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较行重复测量方差分析，两两比较行LSD-t检验，计数资料以（%）表示，组间行χ2检验，预测价值采用受试者工作曲线（receiver operator characteristic，ROC）分析，结果以曲线下面积（area under curve，AUC）表示，以AUC＞0.75 为判断价值高，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分级见表1。Nrf2 基因多态性检测结果显示CC 型20例，CA 型30 例，AA 型28 例。不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分级比较，差异有统计学意义（χ2=15.452，P＜0.001）。

表1 不同Nrf2 基因型COPD 患者肺功能分级[n（%）]

2.2 Nrf2 基因型与肺功能指标关系 见表2。治疗前和治疗后不同Nrf2 基因型COPD 患者FVC，FEV1%，FEV1/FVC 及MVV 水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 Nrf2 基因型与肺功能指标关系（x±s）

2.3 Nrf2 基因型判断COPD 疗效的ROC 分析 见图1。ROC 分析显示，Nrf2 基因多态性对判断COPD 治疗效果的AUC 为0.796（SE=0.056，95%CI=0.687～0.905，P=0.001），敏感度0.767，特异度为0.729。

图1 Nrf2 基因型判断COPD 疗效的ROC 分析

2.4 不同疗效患者Nrf2 基因型分布 见表3。78 例患者显效48 例，有效17 例，无效13 例。有效率83.33%。不同疗效COPD 患者Nrf2 基因型分布比较，差异有统计学意义（χ2=10.959，P＜0.001，）。

表3 不同疗效患者Nrf2 基因型分布[n(%)]

3 讨论

随着分子生物学研究深入，有关COPD 基因易感性问题逐渐引起临床重视[11]。对COPD 基因易感性的研究可对高风险人群进行早期防治，降低COPD 发生率，并为COPD 临床个体化治疗提供依据，部分患者病情可在早期得到逆转[12]。Nrf2 编码基因位于2q31，通过与抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE）位点结合从而达到调节靶基因表达作用。叶繁等[13]报道显示Nrf2 可调节γ-谷氨酰半胱氨酸合酶水平，影响肺氧化剂谷胱甘肽表达，而ANO 等[14]的研究则说明Nrf2 对变态反应和气道高反应性具有抑制作用，防止黏液细胞和嗜酸性粒细胞增生浸润。上述机制提示Nrf2 在COPD 中可能起到保护防御作用。

Nrf2 与机体抗氧化应激关系密切。当机体受到吸烟、气候变化等因素刺激时，Nrf2 便从Keap1-Nrf2 复合物中解离，通过穿梭运动进入细胞核内，再与ARE 启动子区结合，发挥抑制氧化应激损伤作用[15]。另外，有研究显示Nrf2 可通过调控苯醌还原酶、磷酸肌醇-3-激酶等[16-17]，进一步发挥保护肺功能作用。杨曼等[18]敲除COPD 小鼠模型Nrf2基因，结果显示肺组织损伤加重，肺气肿发生率明显升高，这也说明Nrf2 参与COPD 病理进程。本研究对比不同基因型患者肺功能，结果显示不同基因型患者肺功能分级差异显著，提示Nrf2 单核苷酸多态性可能与COPD 肺功能水平相关，而rs6721961位点基因突变则可能显著增加COPD 风险。

另外，本研究对比了不同疗效患者Nrf2 基因型分布，结果显示AA 型患者总有效率显著低于其他两种分型，提示Nrf2 基因多态性可能影响COPD治疗效果，这也进一步说明Nrf2 基因型与COPD相关。而这对指导临床进行个体化治疗具有重要意义。本研究采用ROC 分析，结果也发现Nrf2 基因型对预测疗效具有较高准确性。因而，对于AA 基因型患者，临床应采取联合治疗，以保证疗效。

综上，Nrf2 基因多态性与COPD 病情相关，检测Nrf2 基因多态性有助于预测疗效，为临床干预提供依据。