乳腺癌患者血清长链非编码RNA mir4435-2HG表达水平与临床病理特征的相关性研究

吕美玲，马婕群，陈海艳

(1.长安大学医院内科，西安 710064；2.陕西省肿瘤医院肿瘤内科，西安 710061；3.西安国际医学中心医院肿瘤科，西安 710100）

乳腺癌(breast cancer,BC)是严重威胁全球女性生命健康最常见的恶性肿瘤，目前高居女性癌症之首，平均每年以4%的速度持续上升且呈年轻化趋势[1-3]，其发病隐匿、致死率高、诊断相对延迟仍是临床存在的重大问题。因此，寻找一种新型且有效的肿瘤标志物为BC 的诊断提供更为准确和及时的信息尤为重要。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)可通过参与转录激活、基因沉默和染色体修饰等影响恶性肿瘤的生物学行为[4]，近年来研究发现lnc RNA mir4435-2HG 具有促进胃癌增殖、迁移和侵袭的作用[5]，其还可用作口腔鳞状细胞癌的预后标志物。目前关于lnc RNA mir4435-2HG 与BC 的关联研究尚未见，因此本研究通过比较BC 组和乳腺良性疾病组血清中lnc RNA mir4435-2HG 相对表达量的差异，分析lnc RNA mir4435-2HG 与BC 患者各临床病理特征的关系，旨在为BC 的诊断和预后判断提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2016年8月～2017年7月长安大学医院收治的52 例BC 患者为BC 组，选择同期49 例乳腺良性疾病患者为乳腺良性疾病组，其中乳腺纤维腺瘤18 例、乳腺囊性增生14 例和浆细胞性乳腺炎17 例，另随机纳入同期45 例体检健康的志愿者为健康对照组。根据TNM 分期BC 组患者包含I 期8 例、II 期21 例、III 期18 例、IV 期5例。淋巴结转移17 例，淋巴结未转移35 例；孕激素受体(progesterone receptor,PR)阳性31 例，阴性21 例；雌激素受体(estrogen receptor,ER)阳性38 例，阴性14 例；人表皮生长因子受体2（Her2）阳性40 例，阴性12 例，本研究经由我院伦理委员会批准，三组的一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

纳入标准：①BC 组纳入患者术后均经病理学检查确诊；②临床资料完整者；③自愿参加且均签署知情同意书。

排除标准：①其他肿瘤史者；②伴有严重器质性疾病和慢性疾病者；③远处器官转移者。

1.2 仪器与试剂 Trizol 试剂购自Invitrogen 公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 扩增试剂盒购自日本ToYoBo 公司，TakaRa Prime-Script RT reagent kit 购自大连宝生物工程有限公司，血清RNA 提取试剂盒购自北京天根公司，ABI 7500 Fast 荧光定量PCR 仪(美国ABI 公司)，lnc RNA mir4435-2HG 及内参引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法 术前空腹抽取受试者静脉血2 ml，于4℃条件下12 000 r/min 离心10 min 分离血清，采用血清RNA 提取试剂盒提取血清总RNA，采用TakaRa Prime-Script RT reagent kit 将血清总RNA 逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测血清lnc RNA mir4435-2HG 和内参基因GAPDH 的水平，lnc RNA mir4435-2HG 引物序列为：F:5’-AGACAAGCCGT GCCTGAG-3’，R:5’-ATCTTTCAGCTGCATTCC GG-3’；GAPDH 引物序列为：F:5’-CGGAGTCAAC GGATTTGGTCGTAT-3’，R:5’-AGCCTTCTCCATG GTGGTGAAGAC-3’。反应条件依次为：95℃预变性2 min，95℃ 5s，60℃25s 共40 个循环，用2－ΔΔCt表示lnc RNA mir4435-2HG 的相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计学软件处理数据，满足正态性分布及方差齐性的计量资料以(x±s)表示，采用t检验，呈非正态分布，用M(P25，P75)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H 检验，两组间比较采用非参Mann-WhineyU检验，lnc RNA mir4435-2HG 的诊断价值分析采用ROC 曲线。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组lnc RNA mir4435-2HG 相对表达量的比较 血清lnc RNA mir4435-2HG 在BC 组[2.04(1.41，3.96)]，乳腺良性疾病组[1.21(1.00，1.39)]和健康对照组[0.99(0.84，1.15)]的相对表达量比较，差异具有统计学意义(H=28.73，P=0.00)，BC 组血清lnc RNA mir4435-2HG 的相对表达量高于乳腺良性疾病组(U=89.23，P=0.01)和健康对照组(U=91.46，P=0.02)。

2.2 血清lnc RNA mir4435-2HG 与患者临床病理特征的关系 见表1。BC 患者血清lnc RNA mir4435-2HG 与年龄和肿瘤大小无显著的相关性(P＞0.05)，而与淋巴结转移、TNM 分期、ER，PR 和Her2 有显著的相关性(P＜0.05)，差异均有统计学意义。

表1 血清lnc RNA mir4435-2HG 与患者临床病理特征的关系[M(P25,P75)]

2.3 lnc RNA mir4435-2HG 诊断BC 的ROC 曲线 见图1。绘制lnc RNA mir4435-2HG 诊断BC 的ROC曲线，曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.84(95%CI:0.72～0.91，P＜0.01)，参考约登指数的最大值确定lnc RNA mir4435-2HG 诊断BC 的最佳截断值为0.69，该截断值对应的灵敏度和特异度分别为80.25%和70.91%。

图1 lnc RNA mir4435-2HG 诊断BC 的ROC 曲线

3 讨论

BC 位居女性恶性肿瘤的首位，约占全身恶性肿瘤的10%，每年约以4%的速度持续上升[6-7]。其致死率高且起病较隐匿，严重危害女性的身体健康。目前，临床上使用的CA153 被指灵敏度和特异度均不高[8-10]。基于此，寻找一种新型且有效的肿瘤标志物为BC 的诊断提供更为准确、及时的信息意义重大。Lnc RNA 可通过表观遗传和转录及转录后的调控等在肿瘤中发挥多种生物学功能。早期lnc RNA mir4435-2HG 研究主要是在色素性视网膜炎作用方面，MIAO 等[11]近期指出lnc RNA mir4435-2HG 促进胃癌的增殖、转移和迁移，早期有文献报道指出血清lnc RNA mir4435-2HG 在口腔鳞状细胞癌中呈异常低表达且其具有较好的预测预后的价值。倪文昌等[12]指出lnc RNA mir4435-2HG 可通过靶向miR-873-5p 调控神经母细胞瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。QIAN 等[13]指出lnc RNA mir4435-2HG 在肺癌组织中呈高表达，高表达的mir4435-2HG 可促进肺癌细胞的增殖与侵袭作用。

目前在临床诊疗中BC 通用的肿瘤标志物为ER，PR 和Her2。ER 和PR 是女性重要的激素受体，同时也是激素依赖性BC 患者较直观的肿瘤标记物。ER 和PR 与激素反应生成的复合物对癌组织分化、增殖发挥重要作用。Her2 是内源性的跨膜受体糖蛋白，其具有较强的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性，可显著提升癌组织的增殖活性，因此Her2常与癌组织分化程度相关联。本研究结果提示lnc RNA mir4435-2HG 与ER，PR 和Her2 呈显著相关关系，提示高表达的lnc RNA mir4435-2HG 可能成为ER，PR 和Her2 BC 的靶点。

本研究结果显示，血清lnc RNA mir4435-2HG在BC 中呈高表达，这可能是由于lnc RNA mir4435-2HG 扮演癌基因的角色，表达于BC 患者循环外周血液中，其可为BC 的诊断提供参考和依据。血清lnc RNA mir4435-2HG 与BC 患者的某些病理特征有关，比如淋巴结转移，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能参与了BC 的侵袭迁移过程；TNM 分期，提示lnc RNA mir4435-2HG 可能参与了BC 的恶性转化。ROC 曲线结果显示，lnc RNA mir4435-2HG诊断BC 的最佳截断值为0.69，灵敏度和特异度分别为80.25%和70.91%。

综上所述，lnc RNA mir4435-2HG 在BC 血清中高表达，可作为BC 的潜在生物学标志物。但由于本研究选取的样本数量有限，且缺少预后和疗效观察的相关研究。在后续工作中，将加大样本研究数量、进行随访和功能研究，以进一步验证lnc RNA mir4435-2HG 在BC 中的诊断和应用价值。