血清microRNA-337表达水平对自拟强肾健脾通络汤方剂治疗早期糖尿病肾病获益的诊断价值研究

刘红梅，张月，刘晓曼，安致稳，王 倩（唐山市中医医院，河北唐山 063000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）可进展为终末期肾脏病，严重威胁着人们的生命安全[1-3]，及早治疗可在一定程度上抑制其进展[4]。目前，临床主要应用降糖、降压、降脂等药物延缓糖尿病肾病进展，但对于降低微量蛋白尿的效果有限[5-6]。中医对糖尿病肾病的治疗有独到见解，可控制患者病情，并改善相关指标水平[7-9]。本研究用自拟强肾健脾通络汤治疗早期糖尿病肾病，效果显著，但仍有部分患者对治疗不敏感，因此，及早评价治疗获益尤为重要。微RNA-377（microRNA-377，miR-377）可通过调控炎症因子水平损伤糖尿病肾病大鼠肾脏足细胞[10]，其水平与肾脏损伤有关，或可反映治疗获益情况。目前，鲜有研究分析miR-337 对糖尿病肾病治疗获益的诊断价值。本研究主要分析miR-337 评价自拟强肾健脾通络汤方剂治疗早期糖尿病肾病获益的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2017年4月～2018年11月在唐山市中医医院就诊的136 例早期糖尿病肾病患者作为研究对象，年龄33～69（46.80±7.14）岁，男性75 例，女性61 例。纳入标准：诊断符合《糖尿病肾病防治专家共识（2014年版）》[11]和《糖尿病肾病中医防治指南》[12]，临床分期为Ⅲ期，签署知情同意书。排除标准：认知功能障碍或伴精神疾病，严重心、肝、肺等脏器功能异常，伴感染性疾病，妊娠期或哺乳期妇女，对本研究药物过敏或退出研究。根据治疗获益分为预后良好组（n=84）和预后不良组（n=52）。两组的年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、病程和吸烟史比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究经唐山市中医医院医学伦理委员会批准。

表1 两组基线资料比较（±s）

表1 两组基线资料比较（±s）

类别预后良好组（n=84）预后不良组（n=52）t/χ2P年龄（岁）47.35±6.8145.92±7.621.1310.260男性46290.0130.909 BMI（kg/m2）25.76±3.8125.74±4.450.0320.974病程（年）7.08±1.276.96±1.200.5540.581吸烟41270.1250.724

1.2 试剂与仪器 TAKARA 9108 RNAiso Plus 9108 trizol RNA，6011A PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（日本TAKARA 公司）；紫外分光光度计（上海光学仪器五厂有限公司）；PCR 仪（美国Bio-Rad 公司），miR-337 及内参U6 引物（上海吉玛制药技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治疗方案：给予常规治疗，包括饮食、运动干预，降糖、降压和降脂治疗等。在常规治疗基础上给予自拟强肾健脾通络汤治疗。自拟强肾健脾通络汤组方：黄芪15 g，党参10 g，白术10 g，益智仁15 g，芡实10 g，金樱子10 g，菟丝子10 g，水蛭3 g，桃仁10 g，甘草6 g。上述药物煎服，每天早、晚各服用1 次，12 周为1 疗程。

1.3.2 治疗获益评价标准：随访2年，每3 个月随访1 次，末次随访时间为2020年11月28日，将临床分期进展为Ⅳ期、血肌酐水平翻倍、接受肾脏替代治疗或全因死亡定义为预后不良。

1.3.3 信息收集：收集年龄、性别、BMI，吸烟史、糖尿病病程、估算的肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿酸（uric acid，UA）和尿清蛋白/肌酐比值（urine albumin/creatinine ratio，UACR）等信息。

1.3.4 miR-337 水平检测：用实时荧光定量PCR法（RT-qPCR）[13]检测血清miR-337 水平。抽取受试者治疗前、治疗后肘部静脉血10 ml，离心后取上清，将其保存在-80℃冰箱中保存，待验。用TRIzol 提取血清中总RNA，用逆转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，然后用PCR 仪扩增cDNA，扩增条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 60 s，40个循环，63 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。miR-337 序列F：5’-CTCAACTGGTGTCGTCCAGTCGGCA-3’，R：5’-ATTCAGTTGAGGAAGAAAGG-3’；内参序列U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。用2-ΔΔCt计算miR -337 相对水平。

1.4 统计学分析 用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，两组治疗前、后的miR-337 水平比较用重复测量方差分析，率的比较用χ2检验，用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评估miR-337 诊断治疗获益的价值，用Logistic 回归分析治疗获益的独立风险因素，用限制性立方样条拟合Logistic 回归分析miR-337 与治疗获益的剂量-效应关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肾功能指标比较 见表2。两组的UA 水平差异无统计学意义（t=1.287，P＞0.05），预后良好组的eGFR 水平高于预后不良组，BUN，Scr和UACR 水平低于预后不良组，差异均有统计学意义（t=6.119，5.798，3.704，5.506，均P＜0.05）。

表2 两组肾功能指标比较（x±s）

2.2 两组miR-337 水平比较 见表3。两组的miR-337 水平差异有统计学意义（F=24.876，P=0.000），预后良好组治疗后miR-337 水平低于预后不良组（P=0.000）；治疗前、后的miR-337 水平差异有统计学意义（F=339.737，P=0.000），两组治疗后的miR-337 水平均降低；预后和时间之间存在交互效应（F=22.794，P=0.000），治疗后，两组的miR-337 水平降低程度不同，预后良好组的miR-337 水平降低程度高于预后不良组（P=0.000）。

表3 两组miR-337 水平比较（x±s）

2.3 miR-337 评价早期糖尿病肾病治疗获益的效能见图1。治疗前miR-337 评价治疗获益的ROC 曲线下面积（AUC）、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.568（95% CI：0.470～0.667），1.64，86.54%和28.57%；治疗后miR-337 评价治疗获益的ROC AUC，最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.837（95% CI：0.764～0.910），1.57，65.38%和90.48%；差值miR-337 评价治疗获益的ROC AUC，最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.722（95% CI：0.638～0.806），0.44，88.46%和46.43%。治疗后miR-337 评价治疗获益的ROC AUC 高于治疗前miR-337和差值miR-337，差异均有统计学意义（Z=6.039，P=0.000；Z=2.288，P=0.022）。

图1 miR-337 评价治疗获益的ROC 曲线

2.4 早期糖尿病肾病治疗获益的Logistic 回归分析 见表4。将治疗获益作为因变量，将eGFR，BUN，Scr，UACR 和miR-337（治疗后）作为自变量，多因素Logistic 回归分析结果显示，高水平的eGFR是治疗获益的独立保护因素（P=0.000），高水平的Scr，UACR 和miR-337 是治疗获益的独立危险因素（P=0.019，0.005，0.000）。

表4 早期糖尿病肾病治疗获益的Logistic 回归分析

2.5 miR-337 与早期糖尿病肾病治疗获益的剂量-效应关系 见图2。用限制性立方样条拟合Logistic 回归分析miR-337 与治疗获益的剂量-效应关系，当节点个数为3 时，AIC 值最小（AIC=136.065），结果显示miR-337 与治疗获益有关（χ2=32.89，P=0.000），呈线性关系（非线性检验χ2=0.76，P=0.382）。以miR-337 评价治疗获益的最佳截断点作为参考点，当miR-377 ＜1.57时，治疗获益率增加；当miR-337 ＞1.57 时，治疗获益率降低。

图2 miR-337 与治疗获益的限制性立方样条图

3 讨论

抑制早期糖尿病肾病进展可有效改善患者预后[14-15]。中医学认为肾是人体的先天之本，主藏精，需水谷精微补充与化生；脾是人体的后天之本，主运化，需肾中阳气温煦。本研究在“脾病及肾”、“脾胰同源”理论下用自拟强肾健脾通络汤治疗早期糖尿病肾病，经临床观察，效果明显，但仍有部分早期糖尿病肾病患者经自拟强肾健脾通络汤治疗后远期获益甚微。miR-337 已被报道参与了黑色素瘤[16]和胰腺导管腺癌[17]的发病和进展过程，并可反映患者预后。本研究认为miR-337 可能是早期糖尿病肾病治疗获益的潜在生物标志物，因此，开展本研究，分析miR-337 诊断早期糖尿病肾病治疗获益的价值。

本研究结果显示预后良好组的治疗后miR-337水平低于预后不良组，且预后良好组治疗后的miR-337 水平降低程度高于预后不良组，上述结果提示miR-337 与治疗获益有关，可能是评价治疗获益的潜在生物标志物。遂构建了miR-337 评价治疗获益的ROC 曲线，结果显示治疗后miR-337 对治疗获益有一定诊断价值。

进一步用Logistic 回归分析自拟强肾健脾通络汤治疗早期糖尿病肾病获益的风险因素，结果显示，miR-337 是治疗获益的独立危险因素，此外，限制性立方样条拟合Logistic 回归分析结果显示miR-337 与治疗获益呈线性关系，当miR-377 ＜1.57 时，治疗获益率增加；当miR-337 ＞1.57 时，治疗获益率降低。推测其原因是自拟强肾健脾通络汤方剂可调节miR-337，miR-337 可靶向调控白细胞介素-6 和白细胞介素-18 水平加重肾脏损伤[10]，其水平可反映治疗获益。本研究结果还显示高水平的eGFR 是治疗获益的独立保护因素，高水平的Scr和UACR 是治疗获益的独立危险因素，与已报道文献[18-20]结果一致。

综上所述，血清miR-337表达水平对自拟强肾健脾通络汤方剂治疗早期糖尿病肾病获益有一定诊断价值。