深圳地区类风湿关节炎患者IL-17A基因rs2275913位点多态性与血清中IL-17A，IL-38水平表达的相关性研究

雷明玲，彭常基，张肄鹏，杨海珊

（1.深圳市龙华区中心医院检验科，广东深圳 518110；2.深圳市龙岗区南湾预防保健所，广东深圳 518114）

类风湿关节炎（rheumatic arthritis，RA）是以侵蚀性关节炎为主要病变的一种全身慢性自身免疫性疾病，主要表现为关节炎症、滑膜T 细胞浸润及滑膜增生，并伴有软骨和骨的侵蚀及渐进性关节破坏，其致畸和致残率高，严重影响人们健康和生活质量[1-2]。但RA 发病机制至今不明，有研究表明，RA 发病可能与炎性细胞因子产生有关，其中白介素-17（IL-17）是辅助性T 细胞17（Th17）分泌的一种主要效应因子，能诱发并促进炎症发生，与RA 发生和发展有关[3-5]。IL-38 是最近新发现的一种抑炎因子，与IL-36 受体结合，能抑制Th17 相关细胞因子如IL-17，IL-22 等的合成，在自身免疫性关节炎中发挥抗炎作用[6-8]。同时研究表明，IL-17基因单核苷酸多态性可影响IL-17 的产生而与多种自身免疫性疾病有关，其中IL-17F 基因多态性与RA 发病相关性已见报道[9]，但IL-17A 基因多态性与RA 发病相关性未见报道，且基因多态性分布具有区域和种族性差异。为此，本研究对深圳地区103 例RA 患者和116 例非RA 健康人群IL-17A基因rs2275913位点多态性与血清中IL-17A，IL-38水平表达的相关性进行了对比分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选择2019年2月～2020年10月在深圳市龙华区中心医院确诊的RA 患者103 例，其中男性27 例，女性76 例，男∶女为1∶2.81，年龄35～72 岁，平均年龄49.63±12.75 岁。所有患者均符合RA 诊断标准，并根据RA 疾病活动度评分标准（DSA280）[10]进行分期，其中轻度活动组29 例（DSA28＜3.2），中度活动组56 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活动组18 例（DSA28＞5.1）。纳入标准：①符合RA 诊断标准；②初确诊者；③未使用抗风湿药；④医院伦理委员会同意批准；⑤患者及家属知情同意。排除标准：①伴有其他自身免疫性疾病者；②病情加重者；③伴有肿瘤、糖尿病及血液等疾病者；④伴有严重器质性病变者；⑤需采取非常规治疗者；⑥怀孕及哺乳期妇女。选择同期非RA 疾病的健康人群116 例，其中男性31 例，女性85 例，男∶女为1∶2.74，年龄33～74 岁，平均年龄50.27±13.52 岁，均无自身免疫性疾病、骨及关节相关性疾病。确保两组的年龄、性别及男女比例等一般性资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂 DXI800 全自动化学发光免疫分析仪由美国Bankman 公司提供；DNA 提取试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供；ABI7500 PCR基因扩增仪由美国ABI 公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：于清晨空腹采集5 ～6ml 静脉血，其中2～3ml 加入乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管内上下充分颠倒混匀用于全血DNA 提取，剩余的加入无抗凝剂的一次性干燥管内，30min 后分离血清用于IL-17A，IL-38 及RF 水平检测。

1.3.2 IL-17A，IL-38 及RF 水平测定：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清中IL-17A 和IL-38水平，RF 水平采用免疫比浊法进行检测，所有操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行，并由专人成批次检测，确保结果的准确性和可比性。

1.3.3 全血DNA 提取：采用DNA 提取试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司提供）提取外周血中单个核细胞的基因组DNA，对合格的DNA 提取标本用双蒸水稀释至100ng/L，于-20℃冰箱内备用。

1.3.4 多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法对IL-17A基因rs2275913位点多态性进行分析，具体操作参照文献[11]。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 5 软件，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，两组间比较采用χ2检验，多组间比较采用方差检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-17A，IL-38 及RF 水平比较 见表1。RA 组IL-17A 和RF 水平比对照组明显升高，而IL-38 水平比对照组明显降低，两组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组IL-17A，IL-38 及RF 水平比较（x±s）

2.2 RA 组不同活动度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比较 见表2。RA 组随着病情活动度的加重IL-17A 和RF 水平明显升高，而IL-38 水平明显降低，不同活动度间差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 RA 组不同活动度患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比较（x±s）

2.3 两组IL-17A基因rs2275913位点基因型和等位基因检出率比较 见表3。RA 组IL-17A基因rs2275913位点AA 基因型和A 等位基因检出率比对照组明显升高，两组差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组IL-17A基因rs2275913位点基因型和等位基因检出率比较[n(%)]

2.4 RA 组不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF水平比较 见表4。RA 组AA 基因型IL-17A 水平比AG 和GG 基因型明显升高，而IL-38 水平明显降低，不同基因型之间差异均有统计学意义（均P＜0.05），但不同基因型RF 水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

表4 RA 组不同基因型患者IL-17A，IL-38 及RF 水平比较（x±s）

2.5 RA 组IL-17A 与IL-38，RF 水平相关性分析 RA组IL-17A 和RF 水平明显升高，而IL-38 水平明显降低，经Spearman 相关性分析，结果显示RA 组血清中IL-17A 与RF 水平呈正相关（r=0.5012，P＜0.05），而与IL-38 水平呈负相关（r=-0.6924，P＜0.05）。

3 讨论

IL-17 主要由活化的T 细胞产生诱导炎症反应的一种早期启动因子，与受体结合后，可通过丝裂原活化蛋白（MAP）激酶和核转录因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途径促进T 细胞激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生IL-6，IL-8，粒细胞-巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）、化学增活素及细胞黏附分子1（cellular adhesion molecule 1，CAM-1）等多种细胞因子，从而导致炎症产生。另外，IL-17 还可通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。有研究表明，IL-17 与RA 的发生和发展有密切关系，甚至发挥了至关重要的作用[4-5,12]。RF 是一种抗人或动物IgG 分子Fc 片段抗原决定簇的自身抗体，与体内变性结合形成免疫复合物是导致自身免疫病骨关节损伤的主要病理基础，与关节、骨侵蚀及关节外表现发病有一定关系，可作为评价RA 病情与预后的一个重要指标，是诊断RA 最早的血清学指标[13]。IL-38 是IL-1 家族成员之一，可与IL-1R1，IL-36R及类IL-1R 辅助蛋白1（IL-1RAPL1）结合，可通过抑制NF-kB，丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）等下游信号通路，抑制许多炎症因子产生而发挥抑炎作用。同时IL-38 可调节巨噬细胞和树突状细胞，继而抑制Th17 细胞反应。此外，IL-38 还可调控滑膜成纤维细胞，抑制骨质破坏与血管生成。有研究表明，IL-38 在RA 的发生和发展过程中具有重要的抑炎作用[14-15]。本研究结果显示，RA 组IL-17A 和RF水平明显升高，且随着病情活动度加重而明显上升，与有关文献[3-4,13]报道基本一致，这表明IL-17A 在RA 的发生和发展过程中扮演着重要的促炎角色，可能是促进RA 炎症反应的重要触发因子，从而引起RF 水平升高。而IL-38 水平明显降低，与张继云等[7]报导的基本一致，而与肖盼盼等[4]报导的不同，这可能与不同机构所收集的RA 患者病情严重程度不同有关，但IL-38 水平随病情活动度加重而明显下降的结论基本一致，这表明了在RA 发生和发展过程中IL-38 水平降低会导致其对炎症的抑制作用减弱，从而导致促炎因子大量产生，加速疾病的进程。此外，结果还显示，RA 组IL-17A 与RF 水平呈正相关，而与IL-38 水平呈负相关，这可能与IL-17A 的促炎和IL-38 的抑炎互相作用有关。

RA 病因与发病机制目前尚不完全清楚，多数研究者认为RA 发病是遗传与环境因素共同作用的结果。随着分子生物学技术不断深入研究发现，多种细胞因子基因多态性可增加RA 发病风险，与RA 的发生和发展有密切关系[16-17]。IL-17A 位于一个与RA 相关的基因组区域的染色体6p12 上，其基因多个位点存在多态性。有研究表明，IL-17A 基因位点多态性与RA 发病有关，且存在区域和种族性差异，如LEE 等[18]研究发现高加索人RA 患者与健康人群IL-17A基因rs2275913位点基因型及等位基因频率存在明显差异，与RA 发病有密切关系，而DHAOUADI 等[19]研究发现与突尼斯地区RA 易感性缺乏相关性。本研究结果显示，深圳地区RA患者IL-17A基因rs2275913位点AA 基因型和A等位基因检出率比健康人群明显升高，这表明IL-17A基因rs2275913位点多态性与深圳地区RA 发病有一定相关性。同时AA 基因型RA 患者IL-17A水平明显升高，而IL-38 水平明显降低，这可能与IL-17A基因rs2275913位点多态性能提高IL-17，其他促炎细胞因子及趋化因子表达水平，进而抑制抑炎因子水平及功能等有关。

综上所述，RA患者IL-17A和RF水平明显升高，而IL-38 水平明显降低，且与病情的活动度有密切关系，加强IL-17A，RF 和IL-38 水平检测对RA 的诊断及严重程度的判别诊断具有重要的参考价值。同时IL-17A基因rs2275913位点多态性与深圳地区RA 发病易感性具有相关性，其中AA 基因型可能是该地区RA 发病的易感危险基因之一。