广东省深圳地区类风湿关节炎患者血清25-（OH）VitD3水平及其受体基因rs2228570 T/C位点多态性的相关性研究

高柳冰，郭玲玲，郭燕妳，杨荣志，王兴煌，林 奎

[1.深圳市中西医结合医院检验科，广东深圳 518104；2.中国科学院大学深圳医院（光明）西院区检验科，广东深圳 518106]

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以关节、骨及滑膜慢性炎症为主的一种自身免疫性疾病，其病因和发病机制至今尚未十分阐明，多数学者认为RA 由遗传、环境、激素及感染等多种因素共同作用所致的，其中遗传因素在RA 发病过程中发挥了重要的作用，约53%～60%RA 发病是由遗传因素所引起的[1-3]。随着全基因组研究发现，RA 是一种多基因遗传性疾病，与多基因突变有关。有研究表明，维生素D（vitamin D，VitD）受体（vitamin Dreceptor，VDR）基因多个位点突变与RA发病有关，且VDR 基因突变可能影响25-（OH）VitD3 水平表达或改变其结构，且不同地区人群因遗传背景、环境、生活条件及习惯等因素不同而造成25-（OH）VitD3 水平及VDR 基因多个位点突变分布具有地域和种族性差异[4-7]，虽然国内一些地区已有相关研究报道，但至今未见深圳地区相关报道。本研究对深圳地区RA 患者和健康人群血清中25-（OH）VitD3 水平及VDR 基因rs2228570 T/C 位点多态性进行了对比研究分析，探讨其与RA 发病之间的相关性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2019年6 ～12月期间来深圳市中西医结合医院和中国科学院大学深圳医院（光明）西院区门诊和住院就诊并确诊为RA 患者126 例为RA 组，其中男性35 例，女性91 例，年龄26～57 岁，平均年龄32.85±8.73 岁。所有患者均符合RA 诊断标准，排除其他自身免疫性疾病，并根据RA 疾病活动度评分（DSA28）对患者进行分期[8]，其中轻度活动组47 例（DSA28＜3.2），中度活动组52 例（3.2＜DSA28＜5.1），高度活动组30 例（DSA28＞5.1）。纳入标准：①符合《类风湿关节炎诊断治疗指南》[8]中的诊断标准；②初诊病例；③未使用抗风湿药；④医院伦理委员会同意批准；⑤患者及家属签署知情同意书。排除标准：①长期卧床或长期未接受阳光照射者；②饮食不能正常进行者；③伴发肿瘤、肝、肾及糖尿病者；④RA 病情加重或并发严重并发症或疾病需采取非常规治疗者；⑤近期服用维生素D 类似物者；⑥不配合者。并选取同期来院体检的健康非RA 人群120 例，其中男性30 例，女性90 例，年龄24～55 岁，平均年龄31.45±6.62 岁。确保两组性别、年龄及种族比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂 c8000 全自动化学发光免疫分析仪由罗氏公司提供；DNA 提取试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供；Cobasz-480 PCR 分析仪由瑞士罗氏公司提供；25-（OH）-VitD3 试剂盒由广州菲康生物技术有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：采集清晨空腹2 ～3ml 静脉血于EDTA-K2抗凝管内，混匀用作DNA 提取，另采集2～3ml 静脉血于无抗凝剂的干燥管内，分离血清用作25-(OH)VitD3 水平测定。

1.3.2 25-（OH）VitD3 水平测定：运用化学发光免疫法对血清中25-（OH）VitD3 水平进行检测，严格按照仪器、试剂说明书进行，由同一专业人员成批检测。

1.3.3 DNA 提取：用DNA 提取试剂盒提取血浆中的基因组DNA，并采用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，合格后的DNA 将浓度调整到50ng/μl，于-20℃C 储存备用。

1.3.4 VDR 基因rs2228570 位点多态性分析：采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCRRFLP）法对IL-17 rs763780 基因多态性进行检测，具体操作参照有关文献[9]。

1.4 统计学分析 采用GraphPad Prism 5 软件，计量资料以平均值±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，两组比较采用χ2检验，多组间比较采用方差检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组25-（OH）VitD3 水平比较 RA 组血清25-（OH）VitD3 水平（31.57±9.36nmol/L）明显低于对照组（65.92±14.57nmol/L），两者差异有统计学意义（t=9.1542，P=0.0137），其中RA 组男性（42.16±11.75nmol/L）明显高于女性（27.50±8.12nmol/L），两者差异有统计学意义（t=6.1374，P= 0.0209），而对照组男性（63.95±13.80nmol/L）略低于女性（66.58±15.09nmol/L），两者差异无统计学意义（t=0.9452，P=0.1295）。

2.2 不同严重程度RA 患者25-（OH）VitD3 水平比较高度活动组25-（OH）VitD3 水平（19.37±5.82nmol/L）明显低于中度活动组（30.69±8.63nmol/L），而中度活动组明显低于低活动组（38.32±10.78nmol/L），不同严重程度间差异有统计学意义（F=17.9351，P=0.0082）。

2.3 两组VDR 基因rs2228570 T/C 位点基因型和等位基因检出率比较 见表1。RA 组VDR 基因rs2228570 T/C 位点CC 基因型和C 等位基因检出率明显高于对照组，两组差异有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 两组VDR 基因rs2228570 T/C 位点基因型和等位基因检出率比较[n(%)]

2.4 RA 组不同性别VDR 基因rs2228570 T/C 位点基因型和等位基因检出率比较 见表2。RA 组VDR 基因rs2228570 T/C 位点CC 基因型和C 等位基因检出率男性明显低于女性，两者差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 RA 组不同性别VDR 基因rs2228570 T/C 位点基因型和等位基因检出率比较[n(%)]

2.5 RA 组不同基因型25-（OH）VitD3 水平比较 CC基因型血清25-（OH）VitD3 水平（18.95±4.59nmol/L）明显低于TC 和TT 基因型（38.62±11.03nmol/L 和41.98±11.92nmol/L），差异有统计学意义（t=5.016 4,5.812 6，P=0.025 9，0.023 6），而TC 和TT 基因型之间差异无统计学意义（t=1.206 8，P=0.117 8）。

3 讨论

RA 是以炎性滑膜炎为主要特征的一种最为常见的自身免疫性疾病，主要病理变化为滑膜细胞增生、间质大量炎性细胞浸润、微血管新生及血管翳形成，当累及关节软骨和骨质时，导致关节畸形和强直，引起关节功能丧失，致残率高达15%，是引起丧失劳动力和致残的主要原因之一。全球RA 发病率约为0.5%～2%，而我国约为3%～5%，且呈逐年上升趋势，好发于女性，约为男性的2～3 倍，任何年龄均可发病，好发于25～50 岁。RA 病因及发病机制目前尚未完全明确，且无有效的治疗方法，为全球最难治的病种之一[10-12]。因此，探索新的RA诊断标记物及发病机制对RA 的诊断、治疗及预防具有重要意义。

VitD 是一类具有生物活性的脂溶性类固醇衍生物，其除了能够增强巨噬细胞趋化和吞噬能力，强化单核细胞、中性粒细胞及其它细胞的抗菌肽活性，提高RA 患者对病原微生物的抵御能力外，还可调控巨噬细胞、树突状细胞、T 和B 淋巴细胞等的生长和分化，发挥免疫调节和抗炎活性[13-15]。而25-（OH）VitD3 是VitD 在血液循环中的主要存在形式，是评价VitD 营养和功能状态的最好指标。有研究表明，RA 患者25-（OH）VitD3 水平明显降低，可能在RA 发生和发展中发挥着重要的作用[16-17]。本研究结果显示，深圳地区RA 血清25-（OH）VitD3 水平明显低于对照组（P＜0.05），与有关文献研究的结论一致[5，11，14，16-17]，但不同机构研究结果存在一定差异，有些相差甚远，这可能与不同地区人群的生活环境、习惯、矿物及阳光照射等诸多因素不同有关。同时结果还显示，RA 女性患者25-（OH）VitD3水平降低较男性患者更加明显（P＜0.05），这说明了女性RA 的发病率为什么比男性高的原因。此外，25-（OH）VitD3 水平随RA 患者病情严重程度的加重而出现明显降低（P＜0.05），这表明了25-（OH）VitD3 表达水平可能与RA 的发生以及病情的发展有关。因此，加强不同地区人群血清中25-（OH）VitD3 水平监测，对RA 诊断、治疗及预防具有一定参考价值。

RA 患者因关节长期存在炎症和遭受破坏，有较高的发病率和高致残率，严重影响患者的生活质量和劳动能力。RA 病因和发病机制十分复杂，随着遗传基因位点突变检测技术的不断深入研究发现，RA 发病与多种基因多个位点突变存在密切关系，且不同地区人群同种基因同一个位点突变分布存在区域性和种族性差异[4-5，7，9，18-19]。本研究结果显示，深圳地区RA 组VDR 基因rs2228570 T/C 位点CC 基因型和C 等位基因检出率明显高于对照组（P＜0.05），与SONG 等[9，19-20]研究的结论基本一致，这表明VDR 基因rs2228570 T/C 位点突变可能与RA 发病有密切关系，其中CC 基因型可能是深圳地区RA 发病的易感危险基因，但与TIZAOUI 等[21]研究的结论不一致，这表明了VDR 基因rs2228570 T/C 位点突变多态性分布存在地域性和种族性差异。同时结果还显示，RA 组女性CC 基因型和C 等位基因检出率明显高于男性（P＜0.05），这表明了女性体内VDR 基因rs2228570 T/C 位点可能更容易发生突变，这也可能是女性RA 患病率为什么比男性高的一个原因。此外，结果显示RA 组CC 基因型25-（OH）VitD3 水平明显低于其它基因型（P＜0.05），这可能与VDR 基因rs2228570 T/C 位点突变可能影响25-（OH）VitD3 水平表达或改变其结构等有关，这为进一步研究RA 发病机制、RA 靶向治疗药物的研发提供了新的方向，具体作用机制有待深入研究。综上所述，深圳地区RA 患者25-（OH）VitD3水平明显降低，女性尤为明显，且与RA 患者病情严重程度有关。同时RA 患者VDR 基因rs2228570 T/C 位点突变呈多态性分布，其中CC 基因型可能是本地区RA 发病的危险易感基因之一。因此，加强不同地区25-（OH）VitD3 水平及其受体基因rs2228570 T/C位点突变分析，为RA诊断、病情判断、治疗及预防提供更为科学的参考依据。