河北医科大学第四医院临床分离厌氧菌分布及耐药性分析

冯军花， 何 京， 唐 杰， 李蓉蓉， 邓艳丽， 张金艳

近年来，随着临床微生物检验的发展，厌氧菌的检出率逐步提高，由厌氧菌引起的机会性感染进入临床诊疗的视野，其感染部位多发，在血液、脑脊液、腹腔、盆腔等均有报道[1-3]。相比一般细菌，厌氧菌体外分离困难，其培养分离率受标本采集和运输、孵育气体环境、培养基成分等多种因素影响，且常因与其他细菌混合感染，临床检验中漏检率高。厌氧菌感染临床治疗多以经验治疗为主，易造成抗菌药物的不规范使用[4-5]。通过分离厌氧菌体外行药物敏感试验，以调整用药方案，抗感染治疗效果可大幅提高[6]。本研究通过对河北医科大学第四医院厌氧菌感染的菌种、感染类型进行流行病学分析，并开展厌氧菌药物敏感试验，以期为临床抗厌氧菌治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2017年1月—2019年12月，本院检验科分离的厌氧菌137株，其中脆弱拟杆菌82株，所有菌株均来自患者非重复感染部位标本。

1.2 方法

1.2.1 菌株复苏 将EP管中冻存的菌株，转种于布氏厌氧血琼脂培养基（美国BBL公司），置于培养罐中使用MPI多功能微生物培养系统抽出空气，充入厌氧气体，35℃培养48 h，连续传代2次后使用。每次传代同时进行耐氧试验，即将菌株接种于血琼脂平板，35℃空气环境培养48 h,无菌生长即为耐氧试验合格。

1.2.2 菌株鉴定 受试菌株分别采用16S rRNA测序、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS）技术、传统生化反应卡进行鉴定。测序引 物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；质谱仪每批次检测以大肠埃希菌ATCC 8739作为质控菌株；生化反应卡每批次检测以卵形拟杆菌ATCC BAA-1296作为质控菌株。

1.2.3 琼脂稀释法药敏试验 根据美国临床与实验室标准化协会（CLSI）M11-A8文件中的规定制备不同浓度梯度抗菌药物的布氏厌氧血琼脂。将待测脆弱拟杆菌分别制备成0.5麦氏浊度单位的菌悬液，吸取1 μL接种于琼脂平板表面，每点接种菌量约为105CFU，形成直径为5～8 mm的菌斑，按照低浓度到高浓度依次接种。在每个系列平板之间，接种一个不含抗菌药物的对照平板，用于生长质控和检测平板接种过程中可能发生的污染。接种10 min后将平板翻转，置于厌氧培养罐中，35 ℃孵育48 h。每批次检测以脆弱拟杆菌ATCC 25285作为质控菌株。将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，获取药物最低抑菌浓度（MIC）。药敏结果的解释和质控范围依据CLSI M100-S29标准判断。

1.2.4 E试验法药敏试验 配置0.5麦氏浊度单位脆弱拟杆菌菌悬液，均匀涂布于布氏厌氧血琼脂上，干燥3～10 min后，将各抗菌药物E试验条依次置于布氏厌氧血琼脂上，放入厌氧培养罐中，35 ℃孵育48 h。每批次检测以脆弱拟杆菌ATCC 25285作为质控菌株。观察脆弱拟杆菌生长情况，读取抑菌圈与E试验条交界处的MIC值。药敏结果的解释和质控范围依据CLSI M100-S29标准判断。

1.2.5 耐药基因检测 按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取脆弱拟杆菌DNA作为模板。PCR扩增耐药基因：甲硝唑耐药基因nim、碳青霉烯类耐药基因cfiA、四环素类耐药基因tetQ、大环内酯及林可霉素类耐药基因ermF。引物序列由上海生工公司合成。PCR 扩增体系30 μL：2 × Taq PCR Master Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，10 mmol/L上、下游引物各1.5 μL。反应35个循环，引物序列及扩增条件见表1。所得产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，目的片段纯化后由上海生工公司双向测序，用BLAST软件与GenBank上已公布的基因序列进行比对。

表1 脆弱拟杆菌耐药基因扩增引物及扩增条件Table 1 Primers and conditions for amplification of resistance genes in Bacteroides fragilis

1.2.6 统计分析 数据分析采用 SPSS 21.0统计软件。对琼脂稀释法与E试验法药敏试验结果进行Wilcoxon秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 厌氧菌鉴定及分布特征

研究共收集厌氧菌137株，所有菌株均经16S rRNA测序鉴定菌种，共鉴定6个属、10个种。MALDI TOF MS技术、传统生化反应卡在种水平鉴定正确率分别为94.2%、85.4%。不同感染部位菌种分布见表2。

2.2 琼脂稀释法药敏分析

共收集脆弱拟杆菌82株，对7种抗菌药物进行琼脂稀释法体外药敏试验，采用CLSI M100-S29标准判断，结果见表3。脆弱拟杆菌对甲硝唑和氯霉素的敏感率较高，均大于90%，其中甲硝唑的敏感率最高（98.8%）；对碳青霉烯类药物的敏感率仅次于甲硝唑和氯霉素，均为78.0%；对克林霉素的敏感率最低，为2.4%。

2.3 E试验法药敏分析

82株脆弱拟杆菌，对7种抗菌药物进行E试验法体外药敏试验，采用CLSI M100-S29判断结果，见表4。结果显示，对甲硝唑的敏感率与琼脂稀释法一致，仍为98.8%；氯霉素的敏感率降低（86.6%），出现中介结果；对碳青霉烯类药物的敏感率均较琼脂稀释法有所降低，两药分别为74.4%和69.5%；对克林霉素敏感率仍最低，为1.3%。

表2 不同感染部位菌种分布Table 2 Distribution of anaerobic species in terms of infection site

表3 82株脆弱拟杆菌琼脂稀释法药敏试验结果Table 3 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by agar dilution assay

2.4 琼脂稀释法与E试验法药敏试验结果统计分析

针对以上药敏试验结果的差异，对两种方法中甲硝唑、氯霉素、亚胺培南、美罗培南的试验结果进行Wilcoxon秩和检验，判断总体分布是否有差别。统计结果显示，琼脂稀释法与E试验法在4种抗菌药物的MIC分布上均无差异，P均＞0.05。见表5。

表4 82株脆弱拟杆菌E试验法药敏试验结果Table 4 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by Etest method

表5 琼脂稀释法与E试验法药敏试验结果统计Table 5 Susceptibility results tested by agar dilution versus Etest method

2.5 脆弱拟杆菌耐药基因分布

82株脆弱拟杆菌中：甲硝唑耐药基因nim扩增结果均为阴性；碳青霉烯类耐药基因cfiA检出率为22.0%、碳青霉烯类耐药菌株均携带cfiA基因，检出率为100%；四环素类耐药基因tetQ检出率为75.6%、四环素耐药菌株tetQ基因的检出率为95.4%；大环内酯及林可霉素类耐药基因ermF检出率为72.0%；克林霉素耐药菌株的ermF基因检出率为74.7%。

3 讨论

厌氧菌作为寄居于人体口腔、肠道的正常菌群，在机体免疫力低下时易导致内源性感染，随着临床对厌氧菌认识的加深，其在医院感染中的检出率逐步提高[9-11]。本研究结果显示，临床送检标本中共分离出厌氧菌137株，共6个属、10个种，其中革兰阴性菌比阳性菌占比高；革兰阴性菌以脆弱拟杆菌为主，占总株数的59.9%， 革兰阳性菌以厌氧消化链球菌为主，占8.0%。由此可知，脆弱拟杆菌在厌氧菌感染中最为常见[12]，可能与其自身特性有关，即对氧的耐受性较高，在空气中暴露12 h仍可存活[13-14]。厌氧菌主要在血培养中检出，占总株数的67.2%，其中又以脆弱拟杆菌检出率最高，在血流感染菌株中占79.3%。Dumont等[15]报道144株厌氧菌引起的菌血症中，脆弱拟杆菌占47.2%。可见其引起的菌血症应当在抗感染治疗中受到关注，而血培养厌氧培养瓶采集标本大大提高了厌氧菌的检出率，相比其他标本，厌氧培养瓶采集血液操作简单，培养瓶内基质液及厌氧环境均可延长细菌存活时间，在一定程度上避免了假阴性结果[16]。普雷沃菌属在血液、口咽部脓肿分泌物、肺脓肿穿刺液中均有检出。Panda等[17]研究发现口咽部鳞状细胞癌患者口腔中普雷沃菌属占比有所提高。本研究中口腔分泌物均取自口腔鳞癌患者，其出现由普雷沃菌属引起的牙周感染可能与此有关。此外，放线菌属、韦荣球菌属作为口腔中的常居菌群，易引起免疫功能低下患者口腔黏膜破溃后感染[18]。厌氧消化链球菌是本研究中检出最多的革兰阳性菌，其在腹腔、口腔、胸腔标本均有分离。Carmel等[19]同样在综述中提出厌氧消化链球菌可引起胸膜腔、腹壁、牙周的急慢性伤口感染。艰难梭菌作为抗生素相关腹泻的主要病因，近来随着微生物检验技术的完善其检出率有所提高。本研究中5株从肠道分离的厌氧菌均为艰难梭菌，长期住院、质子泵抑制剂、广谱头孢菌素等抗菌药物是引起艰难梭菌腹泻的危险因素[20-21]，需要在临床抗感染治疗中引起重视。

近年，因厌氧菌耐药导致的抗感染治疗失败时有发生。本研究选取分离最多的脆弱拟杆菌行药敏试验，使用CLSI推荐的琼脂稀释法，结果发现，甲硝唑的耐药率为1.2%，与Ghotaslou等[22]报道对甲硝唑耐药率在0.5%～7.3%相一致。临床使用甲硝唑抗厌氧菌治疗可取得稳定效果；其次对氯霉素的耐药率6.1%，仍处于较低水平；对碳青霉烯类药物耐药率已达22.0%，需要在临床治疗中予以重视；对克林霉素、四环素、阿莫西林-克拉维酸的耐药率均超过40%，其中克林霉素耐药率最高，达96.3%。由此可见，厌氧菌的耐药情况不容乐观，经验治疗厌氧菌受到限制。但CLSI推荐的琼脂稀释法操作烦琐，一般实验室开展困难[23]，故本研究对比分析了E试验法与琼脂稀释法的差异，以评估E试验法的应用价值。通过比较两种方法抗菌药物的MIC分布，可见E试验法检测MIC出现较多中介结果，抗菌药物的敏感率稍有下降，但耐药率基本不变，Wilcoxon秩和检验结果显示，对于甲硝唑、氯霉素、亚胺培南和美罗培南，两种方法无差异，这与Hughes等[24]报道一致，且E试验法不用消耗太多的人力、物力，操作相对简单，可作为对有需要的患者初筛试验，以避免在抗感染治疗中使用耐药的抗菌药物，而琼脂稀释法可作为确证试验用于流行病学调查，以明确医院内厌氧菌的耐药性变化趋势，为临床治疗提供依据。

研究中针对脆弱拟杆菌的药敏试验情况，对4种耐药基因进行检测。甲硝唑作为抗菌活性最高的抗厌氧菌药物，细菌耐药多由nim基因介导，但本研究中所有受试菌株PCR扩增均呈阴性，其耐药可能与产生其他nim基因亚型或细菌的主动外排作用有关[22]；碳青霉烯类耐药的脆弱拟杆菌均携带cfiA基因[25]，其表达与否与碳青霉烯类药物的MIC密切相关；介导四环素耐药的tetQ基因可编码细菌核糖体保护性蛋白，脆弱拟杆菌四环素耐药多由tetQ基因所致；有研究表明[26]，脆弱拟杆菌对克林霉素的耐药性已广泛流行，且对克林霉素的高水平耐药性是通过ermF基因介导，本研究中脆弱拟杆菌ermF基因携带率已达72.0%。

综上所述，临床分离厌氧菌以脆弱拟杆菌为主，以血流感染最为常见，E试验法对于检测脆弱拟杆菌的药物敏感性具有一定价值，可对临床抗厌氧菌治疗提供帮助。