头孢他啶-阿维巴坦对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌的体外杀菌活性研究

孙 玥， 郑永贵， 隗志翔， 杨 洋， 吴 湜， 郭 燕， 尹丹丹， 胡付品

头孢他啶-阿维巴坦（ceftazidime-avibactam）是目前临床治疗碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌（CRE）、铜绿假单胞菌所致感染的新型酶抑制剂合剂之一。其组分阿维巴坦是一种对A类、C类和部分D类β内酰胺酶具有抑制作用的新型β内酰胺酶抑制剂，能恢复头孢他啶在治疗产上述β内酰胺酶细菌所致感染时的抗菌活性。为观察了解头孢他啶-阿维巴坦在体外的杀菌作用，课题组进行了头孢他啶-阿维巴坦对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株的时间-杀菌曲线研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试菌株 6株临床菌株分别来源于复旦大学附属华山医院、上海交通大学附属瑞金医院、甘肃省人民医院和哈尔滨医科大学附属第一医院，均为已确定基因型与耐药表型的保存菌株。其中，肠杆菌科细菌4株，包括肺炎克雷伯菌2株（表达blaESBL：17-W37-40；表达blaKPC：17-R01-39）、大肠埃希菌2株（表达blaESBL：17-W09-26；表达blaKPC：18-W01-29），铜绿假单胞菌2株（碳青霉烯类敏感：17-W07-23；碳青霉烯类耐药：17-W48-62）。肺炎克雷伯菌标准菌株ATCC 700603和铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 27853为复旦大学附属华山医院抗生素研究所保存菌种。

1.1.2 受试药物与培养基 受试药物溶液由阿维巴坦对照品粉剂（药明康德），头孢他啶标准品粉剂（中国药品生物制品检定所）配制。Mueller-Hinton（MH）琼脂和营养琼脂为英国OXIOD公司商品；阳离子调节MH肉汤（CAMHB）为美国BD公司商品。

1.2 方法

1.2.1 药物敏感性试验和最低杀菌浓度（MBC）测定 根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI）M100-S28和CLSI文件M26-A标准[1-2]，采用肉汤微量稀释法对受试菌进行头孢他啶-阿维巴坦药物敏感性试验并进行结果判读。判读最低抑菌浓度（MIC）结果后，对所有未见细菌生长孔中的菌药混合液取0.1 mL加至无药营养琼脂培养基，置于35℃温箱过夜培养。若受试菌在平板上生长的菌落数≤0.1%接种菌量，即可认为该药物浓度为MBC。MBC/MIC≤4时，认为该药物具杀菌作用[3]。

1.2.2 时间-杀菌曲线试验 参考CLSI文件M26-A等[2,4]所述方法对受试标准菌株和临床分离的共8株菌株进行时间-杀菌曲线试验。

受试菌菌液制备用无菌接种环轻轻接触3个经纯分单菌落的顶部，然后将接种环上的受试菌接种于CAMHB中过夜增菌培养，次日按0.2%接种量重悬于CAMHB，37℃ 150 r/min震荡孵育2 h后，稀释至0.5麦氏浊度，并在CAMHB中进一步1∶1 000稀释得到受试菌菌液。

抗菌药物制备依据受试菌的MIC，使用头孢他啶储备液对倍稀释制备得0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC、32MIC系列浓度，并加入固定浓度的阿维巴坦溶液使其阿维巴坦终浓度为4 mg/L。

取一管未加抗生素的菌液作为生长对照，并对其进行菌落计数，记录为0 h（t0）的菌落数。系列浓度药物与受试菌液混合，于37℃，150 r/min条件下震荡温育。在2、4、6、10、24 h 5个时间点对所有管取样0.1 mL，经相应10倍、100倍稀释后加至无药营养琼脂培养基表面并使用一次性涂布棒涂匀。将所有平板置于35℃温箱过夜培养18 h，次日进行菌落计数以绘制时间-杀菌曲线。

以细菌存活数为纵坐标，时间为横坐标，以t0点为抗菌药物溶液加入受试菌菌液时间点，使用绘图软件Prisim绘制时间-杀菌曲线。细菌存活数下降≥3 lgCFU/mL值，则认为头孢他啶-阿维巴坦在该浓度下对受试菌有杀菌作用。

2 结果

2.1 MIC与MBC

头孢他啶-阿维巴坦对8株受试菌的MIC与MBC结果如表1所示。受试肠杆菌科细菌MIC范围为0.25～1 mg/L，铜绿假单胞菌MIC范围为1～2 mg/L，根据CLSI标准，所有受试菌均对头孢他啶-阿维巴坦敏感。头孢他啶-阿维巴坦对肠杆菌科细菌的MBC均在相应MIC的4倍及以下，具有良好的杀菌效果。而头孢他啶-阿维巴坦对铜绿假单胞菌的杀菌效果不如肠杆菌科细菌，尽管受试菌17-W07-23与17-W48-62对头孢他啶-阿维巴坦敏感，其MBC/MIC＞4。

2.2 杀菌曲线试验

2.2.1 肠杆菌科细菌 头孢他啶-阿维巴坦对受试的两种基因型（blaESBL和blaKPC）的肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌及质控菌株均具有较强的杀菌效果，杀菌曲线见图1～3。在其相应的4倍及以上MIC药物浓度时，肠杆菌科受试菌杀菌曲线下降趋势与时间成正相关，且不随药物浓度改变有明显改变。所有菌株在0～6 h内细菌存活数均减少了≥3 lgCFU/mL，杀菌率达99.9%。当药物浓度小于4 MIC时，尽管在部分时刻杀菌率可达99.9%，但或将发生未杀灭细菌再次增殖的现象，（t+24）h可观察到大量存活细菌。在1MIC药物浓度下，大肠埃希菌blaESBL阳性株17-W09-26于（t+4） h附近，肺炎克雷伯菌blaKPC阳性株17-R01-39及质控菌肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+6）h附近开始出现曲线反跳；在2MIC药物浓度下，肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+10）h附近开始出现曲线反跳。

表1 受试菌株最低抑菌浓度与最低杀菌浓度Table 1 Minimum inhibitory and bactericidal concentrations of ceftazidime-avibactam for the strains tested

图1 头孢他啶-阿维巴坦对肺炎克雷伯菌临床分离株17-R01-39和17-W37-40的时间-杀菌曲线Figure 1 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of K. pneumoniae 17-R01-39 and 17-W37-40

图2 头孢他啶-阿维巴坦对大肠埃希菌临床分离株17-W09-26和18-W01-29 的时间-杀菌曲线Figure 2 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of E. coli 17-W09-26 and 18-W01-29

2.2.2 铜绿假单胞菌 头孢他啶-阿维巴坦对铜绿假单胞菌受试菌18-W01-29与质控菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853杀菌效果较好，但对受试菌17-W07-23杀菌效果不佳，杀菌曲线见图3、4。受试菌18-W01-29与质控菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853在药物浓度大于4 MIC时，所有试验菌株的存活细胞数呈时间依赖性减少，4条曲线基本重合，杀菌率达99.9%。与肠杆菌科细菌类似，当药物浓度小于4 MIC时，头孢他啶-阿维巴坦对铜绿假单胞菌的杀菌曲线存在反跳现象。此外，临床分离株17-W07-23各浓度曲线均出现反跳，在32MIC高浓度头孢他啶-阿维巴坦条件下仍无法被有效杀灭。

图3 头孢他啶-阿维巴坦对标准菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603和铜绿假单胞菌ATCC 27853的时间-杀菌曲线Figure 3 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against reference strains K.pneumoniae ATCC 700603 and P.aeruginosa ATCC 27853

图4 头孢他啶-阿维巴坦对铜绿假单胞菌临床分离株17-W07-23和17-W48-62的时间-杀菌曲线Figure 4 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of P. aeruginosa 17-W07-23 and 17-W48-62

3 讨论

自上世纪90年代起，全球范围内陆续发现了各菌属耐碳青霉烯类细菌[5-7]。耐碳青霉烯类细菌的出现严重影响了碳青霉烯类药物的疗效，其引起的侵袭性感染与病死率高度相关。如今，世界卫生组织已将CRE及耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌列为首批最为重要的病原体，新型抗菌药物的研发与投入使用成为了当前的迫切需求。碳青霉烯酶属于β内酰胺酶的一种，是CRE最主要的耐药机制之一[8]。故将新型β内酰胺酶抑制剂阿维巴坦与对铜绿假单胞菌有着抗菌活性优势的第三代头孢菌素头孢他啶联用，此联合对CRE及耐碳青霉烯类的铜绿假单胞菌均具有良好疗效。

国内外一些针对头孢他啶-阿维巴坦的体外抗菌活性研究进行了实验与分析[9-10]，阿维巴坦是一种对广谱β内酰胺酶以及A类、C类和部分D类β内酰胺酶具有活性的新型β内酰胺酶抑制剂，可有效提高多重耐药和泛耐药肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌对头孢他啶的敏感率。本研究将体外MBC作为静态参考指标，使用时间-杀菌曲线方法对0.5～32 MIC系列浓度下头孢他啶-阿维巴坦的体外杀菌效果进行动态评估。受试菌MBC≤4 MIC时[3]，认为头孢他啶-阿维巴坦对其具有较好的杀菌作用。体外杀菌试验结果显示，头孢他啶-阿维巴坦对产超广谱β内酰胺酶和KPC酶的肠杆菌科细菌及部分敏感铜绿假单胞菌具有良好的杀菌活性。杀菌曲线与相应的MBC结果基本一致。对于多数菌株，头孢他啶-阿维巴坦药物浓度为0.5、1 MIC时不具有杀菌效果，而药物浓度≥4 MIC时，各浓度曲线基本重合，杀菌效果显著。Zhang等[11]的研究同样显示，头孢他啶-阿维巴坦对产KPC酶、部分OXA酶的肺炎克雷伯菌具有显著的杀菌效果。该研究还表明，头孢他啶-阿维巴坦与氨曲南联用对产NDM酶的肺炎克雷伯菌有较强的协同杀菌作用 。

本研究显示，当头孢他啶-阿维巴坦药物浓度低于菌株相应的MBC时，受试菌存活细菌数在短时间下降后再次增多，杀菌曲线出现反跳。对于这种反跳现象，Keepers等[4]研究认为，β内酰胺酶复合制剂杀菌曲线的反跳可能与β内酰胺酶抑制剂的浓度以及不同菌株不同的β内酰胺酶表达水平相关。文献报道对大部分菌株而言，当阿维巴坦用量大于4 mg/L标准浓度时，头孢他啶-阿维巴坦的抗菌效果不随阿维巴坦的浓度增加而明显增加[12-13]，但将阿维巴坦浓度调整为8 mg/L或在6 h时加入额外的阿维巴坦溶液可抑制个别菌株24 h时的曲线反跳[4]。

总之，头孢他啶-阿维巴坦对本实验中多重耐药及泛耐药肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌具有较好的体外杀菌活性，其抗菌作用与和细菌接触的时间在一定时间内呈正相关，属于时间依赖性抗生素。如若剂量不足，其杀菌曲线仍可能在几小时后出现反跳，提示在临床治疗中可采取适当缩短给药间隔的方式维持其血药浓度以达到更好的疗效。