siRNA沉默SCD1基因对MCF-7细胞增殖、凋亡及脂质代谢的影响①

黄慧敏 杨 勇 魏 英 王靳琎 陈琴华 湖北医药学院附属东风医院实验中心十堰442008

女性乳腺癌发病率占全球女性恶性肿瘤的30%,死亡率占女性恶性肿瘤的15%,且发病率呈逐年上升趋势[1]。因此,进一步研究乳腺癌的有效治疗方法具有重要的意义。近年来,脂质代谢紊乱作为乳腺癌的危险因素,受到国内外学者的关注。硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoylcoenzyme A desaturase 1,SCD1)是脂肪酸从头合成的关键酶,广泛参与脂肪代谢,进而影响细胞膜结构及信号传导等生物学功能,与细胞增殖、凋亡及炎症反应等关系密切[2-3]。研究显示SCD1的表达与乳腺癌的发生、发展及预后呈负相关[4-7]。本研究拟通过小干扰RNA(small interfreing RNA,siRNA)干扰技术阻断乳腺癌MCF-7细胞中SCD1表达,通过MTT增殖实验、Annexin V-FITC/PI染色、ELISA等实验,检测SCD1基因沉默后对MCF-7细胞增殖、凋亡及脂质代谢的影响,以期为深入研究SCD1基因在乳腺癌MCF-7细胞中的作用及靶向治疗药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7细胞购自中国科学院细胞库；TRIzol Reagent购自美国Omega公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；SCD1抗体购自美国Abcam公司；荧光二抗购自优宁维公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国Sigma公司；MTT购自南京凯基生物有限公司；胆固醇及三酰甘油试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；全蛋白提取试剂盒购自南京凯基生物有限公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司合成,引物序列见表1；SCD1特异性siRNA干扰序列(SCD1-siRNA)和siRNA阴性对照序列(NC-siRNA)由上海吉玛制药技术有限公司合成,siRNA寡核苷酸序列见表2。

1.2 方法

1.2.1 细胞来源及其培养 人乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液,在5%CO2、37℃条件下培养,当细胞密度达到80%～90%时消化传代,进行各项实验。

1.2.2 细胞转染 实验分成3组:SCD1-siRNA组、NC-siRNA组、Control组。SCD1-siRNA组转染75 nmol/L的SCD1-siRNA,NC-siRNA组转染等浓度的NC-siRNA,Control组加入等体积转染试剂,每组设5个复孔。转染前1 d,取对数生长期MCF-7细胞铺于6孔板,转染前观察细胞生长状态,密度达60%～80%时,按照Lipofectamine2000转染试剂说明书及siRNA说明书进行细胞转染。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

表2 siRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of siRNA

1.2.3 荧光显微镜观察siRNA转染效率 转染前1 d,将约1.0×105个MCF-7细胞种于24孔板,当细胞密度达70%时,给予FAM标记的siRNA进行转染,转染24 h后PBS洗涤2次,倒置荧光显微镜下观察并摄片。荧光显微镜摄片时,激发光为蓝光,激发波长480 nm,各组细胞摄片条件均一致。

1.2.4 RT-PCR法检测SCD1 mRNA表达 按照

1.2.2 转染MCF-7细胞,48 h后收集细胞,TRIzol试剂提取总RNA,逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,RT-PCR检测SCD1的mRNA表达水平,以GAPDH为内参进行目的基因表达的相对定量分析,引物序列见表1。反应程序为:95℃预变性10 min；95℃变性15 s；62℃反应40 s,40个循环,以2-ΔΔCt值表示待测基因mRNA的表达水平。实验重复3次。

1.2.5 Western blot法检测SCD1蛋白的表达 按照1.2.2转染MCF-7细胞,48 h后收集细胞,加RIPA裂解液提取细胞内总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,GAPDH为内参。取等量蛋白进行电泳并转膜后,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,分别加入1∶1 000稀释的SCD1抗体和GAPDH抗体,4℃过夜,加入相应1∶10 000稀释的二抗,室温孵育1 h。ECL发光,UVP凝胶成像系统显影,Image J软件分析目标蛋白的光密度值。

1.2.6 MTT检测细胞增殖活性 按照1.2.2转染MCF-7细胞,48 h后消化细胞并计数,5×103个/孔接种于96孔板,每组设5个复孔。24 h后每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20μl,5%CO2、37℃继续培养4 h,弃去培养基,每孔加DMSO 150μl,低速振荡10 min,酶标仪490 nm波长下测每孔OD值,实验重复3次。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡 ①按照1.2.2转染MCF-7细胞,48 h后弃上清,PBS清洗3遍,每孔加入1×Binding Buffer工作液500μl,并加Annexin V-FITC 5μl,3 min后再加入PI 10μl,轻轻混匀,室温避光孵育10 min,荧光显微镜观察细胞凋亡情况。②转染MCF-7细胞48 h后用不含EDTA·2Na的0.25%胰酶消化并收集细胞至离心管,用4℃预冷的PBS洗涤2次,每孔收集的细胞数不少于1×106个,各离心管中加入1×Binding Buffer 250μl重悬细胞,细胞悬液中加入Annexin V-FITC 5μl,轻轻混匀后间隔3 min,再加入PI 10μl,室温避光孵育10 min,各反应管中加入PBS 300μl,再次混匀后于488 nm的流式细胞仪上进行检测。

1.2.8 细胞胆固醇及三酰甘油水平检测 按照1.2.2转染MCF-7细胞,48 h后收集沉淀,PBS清洗3遍,全蛋白提取试剂提取细胞总蛋白,BCA试剂盒检测总蛋白浓度。细胞内胆固醇及三酰甘油水平按照试剂盒操作说明书测定,并以总蛋白浓度为标准进行校正,酶标仪550 nm波长下检测样本OD值。每组设5个复孔,实验重复3次。

1.3 统计学处理 数据分析及作图均采用GraphPad Prism 8软件。计量数据符合正态分布及方差齐性,以表示,三组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用Dunnett-t检测,P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lipofectamine2000介导FAM标记的siRNA转染效率测定 不同浓度(0、25、50、75 nmol/L)FAM标记的siRNA转染MCF-7细胞,24 h后观察转染率。结果见图1,当siRNA浓度为0 nmol/L时,MCF-7细胞无荧光当siRNA浓度为25 nmol/L时,出现荧光,随着siRNA浓度的增加,荧光强度逐渐增强,当siRNA浓度为75 nmol/L时,荧光强度最强,80%以上MCF-7细胞发绿色荧光,表明有较多siRNA被转染入细胞,故后续实验中所用siRNA浓度均为75 nmol/L。

图1 荧光显微镜观察不同浓度FAM标记的siRNA转染效果Fig.1 Transfection efficiency of different concentrations of FAM-siRNA observed by fluorescence microscope

2.2 RT-PCR法检测siRNA沉默SCD1基因的效率如图2所示,NC-siRNA转染组中SCD1基因的mRNA表达量为0.971±0.043,与Control组(1.0±0.029)相比差异无统计学意义(P＞0.05)；而SCD1-siRNA转染组中SCD1基因的mRNA表达量为0.357±0.026,与NC-siRNA转染组(0.971±0.043)相比显著降低(P＜0.001)。结果提示转染SCD1-siRNA后MCF-7细胞中SCD1 mRNA表达被有效抑制。

2.3 Western blot法检测SCD1基因沉默对SCD1蛋白表达的影响 如图3所示,SCD1-siRNA转染组SCD1蛋白表达水平显著低于NC-siRNA转染组和Control组(P＜0.001),NC-siRNA转染组和Control组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。表明SCD1-siRNA干扰可有效抑制SCD1蛋白表达。

2.4 MTT法检测SCD1基因沉默对MCF-7细胞增殖的影响 如图4所示,Control组MCF-7细胞增殖率为(100.00±2.943)%,NC-siRNA转染组和SCD1-siRNA转染组细胞增殖率分别为(98.54±2.365)%和(82.25±2.112)%。NC-siRNA转染组的细胞增殖率和Control组差异无统计学意义(P＞0.05),SCD1-siRNA转染组细胞增殖率显著低于NC-siRNA转染组(P＜0.01)。表明SCD1基因表达下调后,MCF-7细胞增殖能力受到明显抑制。

图2 SCD1-siRNA转染对MCF-7细胞SCD1 mRNA表达的影响Fig.2 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression ofSCD1 mRNA in MCF-7 cells

图3 SCD1-siRNA转染对MCF-7细胞中SCD1蛋白表达的影响Fig.3 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression of SCD1 protein in MCF-7 cells

2.5 SCD1基因沉默对MCF-7细胞凋亡的影响如图5A所示,Annexin V-FITC将早期凋亡细胞染成绿色,PI可将晚期凋亡细胞的细胞核染成红色。荧光显微镜下,Control组及NC-siRNA转染组凋亡细胞较少,SCD1-siRNA转染组凋亡细胞数明显增多,且早期凋亡细胞多于晚期凋亡细胞。流式细胞凋亡图中,凋亡细胞为早期凋亡细胞数(Q3)与晚期凋亡细胞数(Q2)之和。如图5B所示,Control组、NCsiRNA转染组和SCD1-siRNA转染组细胞凋亡率分别为:(5.76±0.438)%、(7.74±0.467)%和(25.96±1.896)%。NC-siRNA转染组细胞凋亡率与Control组差异无统计学意义(P＞0.05),SCD1-siRNA转染组细胞凋亡率显著上升,与NC-siRNA转染组相比具有统计学意义(P＜0.001)。提示沉默SCD1基因可促进MCF-7细胞凋亡。

图4 SCD1基因沉默对MCF-7细胞增殖的影响Fig.4 Effect of SCD1 gene silencing on proliferation of MCF-7 cells

图5 SCD1基因沉默对MCF-7细胞凋亡的影响Fig.5 Effect of SCD1 gene silencing on apoptosis of MCF-7 cells

2.6 SCD1基因沉默对MCF-7细胞内胆固醇含量的影响 如图6所示,Control组、NC-siRNA转染组、SCD1-siRNA转染组细胞内胆固醇水平分别为:(51.10±4.178)nmol/mg、(48.10±3.229)nmol/mg、(31.29±4.510)nmol/mg。NC-siRNA转染组与Control组细胞内胆固醇水平,差异无统计学意义(P＞0.05)；SCD1-siRNA转染组细胞内胆固醇水平较NC-siRNA转染组显著降低(P＜0.01)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7细胞内胆固醇合成。

图6 SCD1基因沉默对MCF-7细胞内胆固醇含量的影响Fig.6 Effect of SCD1 gene silencing on cholesterol level in MCF-7 cells

图7 SCD1基因沉默对MCF-7细胞内三酰甘油含量的影响Fig.7 Effect of SCD1 gene silencing on triglyceride level in MCF-7 cells

2.7 SCD1基因沉默对MCF-7细胞内三酰甘油含量的影响 如图7所示,Control组、NC-siRNA转染组、SCD1-siRNA转染组细胞内三酰甘油水平分别为:(61.21±8.949)nmol/mg、(58.66±9.132)nmol/mg、(42.49±3.707)nmol/mg。NC-siRNA转染组与Control组细胞内三酰甘油水平差异无统计学意义(P＞0.05)；SCD1-siRNA转染组细胞内三酰甘油水平较NC-siRNA转染组显著降低(P＜0.05)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7细胞内三酰甘油合成。

3 讨论

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是调控基因表达、功能基因组学研究的重要方法,siRNA是RNAi过程中的重要产物,具有高度特异性及级联放大效应等特点,可在转录水平后诱导基因沉默。近年siRNA高效并特异性阻断了多种肿瘤细胞中靶基因的表达,抑制了肿瘤细胞增殖和侵袭,诱导了肿瘤细胞凋亡,目前已成为研究肿瘤基因靶向治疗的重要工具[8-9]。

乳腺癌是全球女性发病率最高的肿瘤之一。研究显示,机体脂质代谢与乳腺癌的发生发展密切相关,肥胖既是乳腺癌发病的高危因素,同时影响其预后[10]。SCD1是催化饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸的限速酶,与脂质代谢紊乱关系密切,在结肠癌、肺癌、肾癌、肝癌等多种癌细胞及肿瘤组织中异常表达。MASON等[11]研究发现,降低结肠癌HCT116细胞中SCD1表达,可阻断脂肪酸的合成从而诱发细胞凋亡；HESS等[12]研究发现抑制肺癌H460细胞中SCD1的表达,可阻断细胞周期进展,诱导细胞程序性死亡从而抑制H460肺癌细胞增殖；VON ROEMELING等[13]发现在肾透明细胞癌组织中SCD1基因呈高表达,同时体内、体外实验均表明SCD1缺陷可诱导细胞凋亡,阻断细胞生长,并促进内质网应激反应；BANSAL等[14]研究发现,SCD1在HepG2等多种肝癌细胞及肝癌组织中高表达,抑制SCD1可显著提高HepG2细胞对化疗药物的敏感性并抑制肝癌细胞增殖。以上研究表明SCD1是癌症治疗的潜在靶点。

研究SCD1在乳腺癌中的作用可为乳腺癌治疗提供新的思路。本研究通过RNAi技术干扰SCD1在人乳腺癌MCF-7细胞中的表达。RT-PCR及Western blot结果显示,经SCD1-siRNA转染后,SCD1 mRNA及蛋白表达显著降低,提示MCF-7细胞中SCD1的表达得到有效抑制。细胞的异常生长与增殖是恶性肿瘤最基本的生物学特征之一,本研究MTT细胞增殖实验显示,SCD1-siRNA转染组的细胞增殖率显著低于NC-siRNA转染组,即SCD1基因表达下调后,MCF-7细胞的增殖能力受到显著抑制。细胞凋亡能力降低是肿瘤细胞和正常细胞的重要区别,本研究进一步通过流式细胞术观察了SCD1沉默对MCF-7细胞凋亡的影响,结果显示SCD1表达抑制后,MCF-7细胞凋亡率显著较高,本研究从反面验证了SCD1具有促进乳腺癌发展的作用。赵静[15]研究发现SCD1抑制剂MF-438干预MCF-7细胞48 h,可显著抑制细胞增殖,并诱导MCF-7细胞凋亡,与本研究结果一致。

细胞增殖失控和能量代谢异常与肿瘤的发生发展密切相关,温伯格效应与脂肪酸合成增加是肿瘤细胞2个标志性代谢改变[16-17]。脂类作为人体三大营养物质之一,具有储存和供应能量、参与信号转导、构成血浆脂蛋白、维持细胞膜结构等重要的生理功能。和正常细胞相比,肿瘤细胞持续分裂增殖的能力显著提高,因此需要合成大量的脂质用于新细胞膜和促癌脂质信号分子的合成,并为肿瘤细胞提供能量支持,因此在肿瘤细胞中脂质从头合成途径被高度激活[18-20]。本实验沉默SCD1基因后,MCF-7细胞内胆固醇和三酰甘油水平显著低于NCsiRNA转染组。黄光明等[21]研究发现,抑制SCD1表达可明显降低肝癌SMMC-7721细胞中胆固醇和三酰甘油水平,曹白鸽等[22]研究发现,SCD1过表达后HepG2细胞内脂滴及三酰甘油合成明显增加,下调SCD1表达细胞内脂滴及三酰甘油合成明显减少。以上研究结合本实验结果表明,SCD1在癌细胞脂质合成过程中发挥重要作用。

综上所述,SCD1是MCF-7细胞中脂质代谢的关键基因,沉默SCD1可显著抑制MCF-7细胞内脂质代谢水平及细胞增殖,并诱导MCF-7细胞凋亡。本研究为乳腺癌的靶向治疗和新药研发提供了新的思路和方法,SCD1抑制剂作为乳腺癌治疗的新药值得进一步研究。