姜黄素对子宫内膜异位症大鼠PI3K/AKT/GSK‐3β通路及肥大细胞活化的影响

曹立花 李丽娟 胡晓丹 张晓钿（海口市中医医院妇产科，海口 570100）

子宫内膜异位症（endometriosis，EM）是一种发生在育龄妇女之间常见的慢性炎症疾病，给个人和社会带来沉重的经济负担［1‐2］。目前，手术是EM治疗的常规方法，但必须权衡手术复发风险和卵巢储备的潜在减少，给EM的手术治疗带来困难，因此开发新药对改善临床EM治疗至关重要［3］。与EM相关的异常免疫细胞包括巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞等，其中肥大细胞活化能够释放炎症因子，导致疼痛发生［4］。姜黄素（curcumin）是姜黄传统药物的一种多酚成分，具有抗氧化、抗炎和抗癌活性，能够改善脑功能、控制肥胖症和糖尿病，还可用作香料和食用色素［5］。JELODAR等［6］研究证实，姜黄素可以预防大鼠EM异位灶组织生长。磷脂酰肌醇3‐激酶（phosphatidylinositol 3‐kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK‐3β）信号通路的减弱与肥大细胞活化较少密切相关，但姜黄素对EM的治疗作用及其机制是否与PI3K/AKT/GSK3β途径相关尚不明确［7］。本研究通过建立EM模型，研究姜黄素对EM大鼠的治疗效果及其对PI3K/AKT/GSK3β通路相关蛋白表达的影响，以期为揭示姜黄素的治疗机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级SD大鼠70只，雌性未孕，6周龄，体重（200±10）g，购自河南省实验动物中心，生产许可证号：SCXK（豫）2017‐0001。实验经本院动物伦理委员会批准，并遵守3R保护原则。

1.1.2 药品与试剂姜黄素（MF‐008974）购自信阳市沐凡生物科技有限公司；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（G1120）、大鼠TNF‐α（SEKR‐0009）、IL‐6（SEKR‐0005）和IL‐1β（SEKR‐0002）ELISA试剂盒购自北京Solarbio公司；PI3K（PA5‐86800）、p‐AKT（PA5‐104866）和β‐肌动蛋白（β‐actin）（PA1‐183）兔抗大鼠多克隆抗体、AKT兔抗大鼠单克隆抗体（MA5‐14916）、山羊抗兔lgG（H+L）（A32731）和山羊抗小鼠IgG（H+L）（A32723）二级抗体购自美国Thermo Fisher Scientific公司；GSK‐3β（ab185141）和p‐GSK‐3β（ab68476）兔抗大鼠单克隆抗体和购自英国Ab-cam公司。

1.1.3 主要仪器MA100N型倒置显微镜由日本Nikon生产；Gel DocTMXR+型凝胶成像仪由美国Bio-Rad公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备参照文献［8］方法，将大鼠禁食24 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，剖开大鼠腹部，分离右侧子宫与周围组织，结扎两端子宫血管后，分离子宫内膜，修剪为5 mm×5 mm的子宫内膜碎片，内膜向里移植入大鼠左侧腹部腹壁后，缝合大鼠腹部。术后连续5 d向上述各组大鼠腹腔注射容量为4 000 U/只的硫酸庆大霉素注射液，术后次日开始给予大鼠0.1 mg/kg的雌二醇（1%羧甲基纤维素纳溶液溶解）灌胃处理，1次/4 d，共灌胃3次，在末次灌胃雌二醇后第4天麻醉大鼠，观察异位内膜形成透明囊状，内有积液和表面血管生成，则造模成功。假手术组进行右侧子宫截取，但不进行左侧异位内膜移植处理，术后次日给予等量1%羧甲基纤维素纳溶液，其余参照上述造模方法进行。

1.2.2 分组及药物处理造模成功大鼠为56只，随机分为模型组（11只，给予等量蒸馏水灌胃）、姜黄素低（11只）、中（11只）、高（12只）剂量组（分别给予60、120和240 mg/kg姜黄素灌胃）、阳性对照组（11只，给予125 mg/kg孕三烯酮灌胃），灌胃1次/d，连续21 d。21 d假手术组（10只，给予等量蒸馏水连续灌胃）［9］。

1.2.3 样品采集末次给药12 h后，戊巴比妥钠麻醉各组大鼠，脱颈处死，剖腹，观察大鼠异位灶个数，参考文献［10］方法，评价盆腔黏连情况，计算异灶面积。分别剪取假手术组正常子宫内膜组织和各实验组异位子宫内膜异位灶组织，部分经脱水、石蜡包埋后制成切片，用于后续实验；其余部分组织分别用PBS清洗后，-80℃保存备用。

1.2.4 HE染色实验取1.2.3各组大鼠切片，经HE染色后，显微镜下观察异位灶组织病理学变化。

1.2.5 甲苯胺蓝染色实验按照试剂盒说明书步骤，对1.2.3各组大鼠组织切片染色后，随机选取5个视野，计每平方毫米肥大细胞个数，取均值。将形态规则、边界清晰的肥大细胞定义为未脱落肥大细胞，周围可见明显颗粒的肥大细胞定义为脱落颗粒肥大细胞。

1.2.6 炎症因子ⅠL‐1β、ⅠL‐6和TNF‐α检测将1.2.3中-80℃保存的组织制备匀浆液，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测异位灶组织中IL‐1β、IL‐6和TNF‐α水平。

1.2.7 蛋白免疫印迹分析实验将1.2.3中-80℃保存的组织匀浆后，加入RIPA提取各组总蛋白并测量蛋白含量。经电泳、转膜、封闭、清洗后，依次加入PI3K、AKT、p‐AKT、GSK3β、p‐GSK3β和β‐actin一抗（1∶1 000）孵育过夜后，添加二抗（1∶5 000）继续孵育2 h，曝光显影，分析蛋白表达水平。

1.3 统计学分析采用SPSS25.0软件进行统计学分析，计量数据均采用±s表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠内异灶和盆腔黏连情况除假手术组外，其余各组内异灶个数差异无统计学意义；假手术组无内异灶，与假手术组相比，模型组EM大鼠内异灶面积和盆腔黏连评分均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，姜黄素低、中、高剂量组EM大鼠内异灶面积和盆腔黏连评分依次降低（P＜0.05），阳性对照组大鼠上述指标均显著降低（P＜0.05），见表1。

2.2 异位内膜组织病理学观察如图1所示，假手术组大鼠子宫内膜完整，上皮细胞柱状排列整齐，腺体自然；模型组大鼠异位内膜组织生长状态良好，腺体上皮细胞和基质细胞均正常；姜黄素低、中、高剂量组大鼠异位子宫内膜上皮细胞形状逐渐变为地单层柱状，腺体和基质细胞数量逐渐减少，并出现空化现象；阳性对照组上述现象介于姜黄素中剂量组和高剂量组之间。

图1 各组大鼠子宫内膜异位灶组织HE染色图片（×200）Fig.1 HE staining pictures of endometriosis tissue in each group（×200）

图2 各组大鼠异位灶组织肥大细胞浸润情况Fig.2 Mast cell infiltration of heterotopic foci in each group

表1 各组大鼠EM内异灶解剖观察结果（±s）Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group（±s）

表1 各组大鼠EM内异灶解剖观察结果（±s）Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

Pelvic adhesion score（points）0.00±0.00 5.42±1.001）4.37±0.672）3.26±0.512）3）2.15±0.482）3）4）3.09±0.332）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Several different foci（piece）0.00±0.00 4.12±1.031）3.73±0.87 4.02±0.62 3.96±0.74 4.25±0.96 Area of heterotopic lesion（mm2）0.00±0.00 49.65±7.071）38.20±9.112）25.54±8.232）3）16.61±9.322）3）4）23.66±7.282）

2.3 姜黄素对EM大鼠异位灶组织肥大细胞数量和活化的影响如图2所示，假手术组异位灶组织肥大细胞及脱颗粒肥大细胞数较少，模型组大鼠肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞数明显增加，而姜黄素低、中和高剂量组大鼠异位灶组织肥大细胞数目无明显差异，脱颗粒肥大细胞相对数量呈减少趋势；阳性对照组的脱颗粒肥大细胞相对数量介于姜黄素中高剂量组之间。与假手术组相比，模型组大鼠异位灶组织肥大细胞总数、脱颗粒肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数比值均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，姜黄素低、中、高剂量组大鼠异位灶组织脱颗粒肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数比值依次降低（P＜0.05），见表2。

2.4 姜黄素治疗对各组大鼠异位灶部位炎症因子表达影响与假手术组相比，模型组EM大鼠异位灶 组 织TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表 达显 著 增加（P＜0.05）；与模型组相比，姜黄素低、中、高剂量组EM大鼠异位灶组织TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表达依次减少（P＜0.05），阳性对照组上述指标显著降低（P＜0.05），见表3。

2.5 姜黄素治疗对各组大鼠异位灶组织PⅠ3K、AKT和GSK‐3β蛋白表达的影响与假手术组相比，模型组EM大鼠异位灶组织PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，姜黄素低、中、高剂量组EM大鼠异位灶组织PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表达依次降低（P＜0.05），阳性对照组上述指标显著降低（P＜0.05），见表4、图3。

表2 各组大鼠异位灶组织中肥大细胞及脱颗粒肥大细胞数比较（±s）Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠异位灶组织中肥大细胞及脱颗粒肥大细胞数比较（±s）Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

Degranulated mast cells/total mast cells 0.21±0.06 0.46±0.051）0.37±0.022）0.25±0.032）3）0.17±0.022）3）4）0.21±0.032）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Total number of mast cells（piece）1.46±0.47 4.13±1.531）3.24±0.51 3.11±0.96 3.96±1.03 4.07±0.88 Number of degranulated mast cells（piece）0.26±0.13 1.69±0.231）0.98±0.262）0.58±0.112）3）0.25±0.132）3）4）0.39±0.092）

表3 各组大鼠异位灶组织TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表达情况（±s，pg/ml）Tab.3 Expressions of TNF‐α，IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group（±s，pg/ml）

表3 各组大鼠异位灶组织TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表达情况（±s，pg/ml）Tab.3 Expressions of TNF‐α，IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group（±s，pg/ml）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

IL‐6 73.49±8.35 135.61±9.921）117.32±7.232）70.58±8.522）3）43.83±9.542）3）4）51.95±8.851）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 TNF‐α 31.14±6.32 98.78±10.431）70.36±9.182）52.52±10.022）3）12.39±3.222）3）4）29.64±5.131）IL‐1β 0.67±0.09 2.44±0.121）2.05±0.082）0.99±0.082）3）0.37±0.132）3）4）0.59±0.101）

表4 各组大鼠异位灶组织中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PI3K，Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group（±s）

表4 各组大鼠异位灶组织中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表达比较（±s）Tab.4 Comparison of PI3K，Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group（±s）

Note：1）P＜0.05 vs Sham operation group；2）P＜0.05 vs Model group；3）P＜0.05 vs Curcumin low dose group；4）P＜0.05 vs Curcumin medium dose group.

p‐GSK‐3β/GSK‐3β 0.29±0.03 0.83±0.061）0.61±0.022）0.36±0.062）3）0.10±0.022）3）4）0.23±0.032）Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 PI3K/β‐actin 0.16±0.03 1.26±0.031）0.98±0.042）0.57±0.062）3）0.21±0.022）3）4）0.34±0.042）p‐AKT/AKT 0.32±0.04 1.18±0.021）0.99±0.072）0.65±0.042）3）0.13±0.032）3）4）0.22±0.022）

3 讨论

通过外科手术将子宫组织移植到腹壁和肠系膜是常见的建立小鼠或大鼠的实验性异位症子宫内膜模型的方法，该模型的广泛应用对EM的发病及治疗机制的研究具有重要意义［10‐11］。研究发现，EM大鼠的恶化程度与内异灶体积大小及盆腔黏连变化密切相关［12‐13］。本研究结果显示，模型组大鼠内异灶个数、内异灶体积和盆腔黏连相较于假手术组均显著升高，提示EM造模成功。此外，模型组大鼠异位内膜组织生长状态良好，腺体上皮细胞和基质细胞均正常，表明EM病灶组织生长未得到有效控制。给予EM大鼠不同剂量的姜黄素治疗后，各组大鼠内异灶体积和盆腔黏连均相应减少，表明姜黄素对EM具有治疗作用，与既往研究结果一致［6］。

肥大细胞在炎症性疾病中至关重要，研究表明，肥大细胞脱颗粒可以释放炎症因子促进EM病理性疼痛持续发生，且EM病变中的肥大细胞和活化数明显增加［14］。病理水平上EM会导致炎症因子表达增加，而改善炎症水平能够阻止异位灶组织生长［15］。本研究结果显示，与假手术组相比，模型组EM大鼠异位灶组织肥大细胞数、肥大细胞总数、脱颗粒肥大细胞数和脱颗粒肥大细胞与肥大细胞总数比值、炎症因子TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表达显著增加，提示EM大鼠异位灶组织肥大细胞及其活化状态升高，处于炎症反应状态。给予姜黄素治疗后，各组异位灶组织肥大细胞脱颗粒占比和上述炎症因子表达显著降低，提示姜黄素可抑制EM大鼠异位灶组织肥大细胞活化，可能与降低炎症反应相关。另有研究证实，姜黄素能够通过减轻炎症反应对高果糖饮食诱导的代谢综合征大鼠和中脑动脉阻塞大鼠产生治疗作用，因此推测姜黄素可能是EM治疗的潜在有效药物，这可能与降低肥大细胞活化，抑制炎症反应相关［16‐17］。

PI3K是细胞信号通路的重要调节剂，LIN等［18］研究发现，抑制PI3K及其下游激酶AKT表达能够抑制肥大细胞活化。徐南辉等［19］利用肥大细胞脱颗粒肽诱导肥大细胞脱颗粒进程，发现PI3K/AKT通路相关蛋白表达明显升高。GSK3β是AKT下游效应分子之一，激活小鼠下丘脑中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/AKT/GSK3β级联反应可触发肥大细胞脱颗粒［20］。本研究结果显示，模型组大鼠异位灶组织中PI3K蛋白、AKT和GSK3β磷酸化水平相较于假手术组显著升高，提示EM大鼠异位灶组织PI3K/AKT/GSK3β信号通路处于激活状态。给予姜黄素治疗后上述蛋白表达水平呈剂量依赖性降低，提示姜黄素能够抑制EM大鼠异位灶组织中PI3K/AKT/GSK3β信号通路激活。在心肺旁手术诱导的脑损伤中，使用PI3K抑制剂降低AKT和GSK3β磷酸化水平可减轻脑组织的炎症反应，抵制脑损伤，因此推测姜黄素可能通过调控PI3K/AKT/GSK3β途径降低异位灶组织的炎症反应，从而达到抑制EM异位灶组织生长的效果，但姜黄素干预下EM大鼠异位灶组织肥大细胞活化受到抑制是否与PI3K/AKT/GSK3β途径相关尚待更深入的探索［21］。

综上所述，姜黄素能够抑制EM异位灶组织生长，可能与抑制PI3K/AKT/GSK3β信号通路、降低肥大细胞活化及炎症反应相关，揭示了姜黄素用于治疗EM的潜在价值。但EM是一种多因素疾病，机制比较复杂，因此本课题组将进一步联合动物模型和临床试验以期提供更多数据支持姜黄素在EM病理学中的治疗效果。