通过MC‐Tryptase‐PAR‐2‐FLS途径探讨资木瓜总苷对K/B×N小鼠血清转移性关节炎的治疗作用①

周婷婷 陈先勇 陈桂婷 曹楠 李世刚（三峡大学医学院，宜昌 443002）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以滑膜增生、关节软骨与骨破坏为特征的慢性自身免疫性疾病，全球发病率为0.5%～1.0%，女性发病率是男性的2～4倍［1］。RA作为高致残性慢性疾病，严重影响患者健康和生活质量，具体发病机制尚未明确。

肥大细胞（mast cell，MC）及其相关细胞因子在RA发病机制中的作用是近年研究热点，研究表明，正常关节中活化的MC约占正常关节滑膜细胞总数的1%～5%，但RA患者滑膜中活化的MC数明显增多，是正常水平的6～25倍，且增加程度与病情活动度相关，滑膜MC常聚集于血管翳和软骨交接及血管翳侵入骨皮质处，通过多种途径引发RA，导致软骨和骨损害［2］。

资木瓜是鄂西南道地药材，具有补肝益肾、舒筋活络、抗炎止痛等作用，主治湿痹拘挛，腰膝关节疼痛，常用于风湿、RA治疗［3］。资木瓜总苷（total sa-ponins ofchaenomeles speciosa，TSCS）是资木瓜主要有效成分。本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠，通过给予KitW‐4Bao小鼠过继移植正常小鼠的骨髓来源肥大细胞（BMMC），探讨TSCS通过抑制MC活化治疗K/B×N小鼠血清转移性关节炎的作用机制［4］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物KRN小鼠，8周龄，雄性，由美国哈佛大学医学院Mathis D.和Benoist C.教授馈赠。SPF级NOD/Lt J小鼠，8周龄，雌性，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，生产许可证编号：SCXK（京）2014‐0004。SPF级C57BL/6小鼠，8周龄，雌性，购于湖北省疾控中心，生产许可证编号：SCXK（鄂）2015‐0018。KitW‐4Bao小鼠，8周龄，雌性，购于杭州师范大学实验动物中心，生产许可证编号：SCXK（浙）2011‐0048。

1.1.2 药品与试剂D101大孔吸附树脂分离纯化TSCS，含量为51%，临用时采用双蒸水配成所需浓度，pH=7.4；小鼠IgG、IL‐6、IL‐17、TPS（Tryptase）、TNF‐α和PGE2ELISA试剂盒（Elabscience公司）；Prime-ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR®Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；Anti‐Mast Cell Trypt-ase和Anti‐PAR‐2（Abcam公司）；Trizol Reagent（Invit-roge公司）；DAB显色试剂盒（北京中杉金桥）。

1.2 方法

1.2.1 K/B×N小鼠血清转移性关节炎模型构建雄性KRN小鼠与雌性NOD小鼠杂交生产的F1代小鼠即为K/B×N小鼠。采用心脏采血法，离心收集2～6月龄K/B×N小鼠血清。8～12周龄的C57BL/6小鼠和KitW‐4Bao小鼠及移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠，在第0、3天分别尾静脉注射150µl K/B×N小鼠血清，构建K/B×N小鼠血清转移性关节炎模型。

1.2.2 分组及给药方案C57BL/6小鼠分别注射C57BL/6小鼠血清及K/B×N小鼠血清作为正常对照组和模型组，KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清作为阴性对照组，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠随机分为3组：阳性药物组、低、高剂量药物组，均注射K/B×N小鼠血清，每组8只。除正常对照组外，其余各组小鼠均构建K/B×N小鼠血清转移性关节炎模型。致炎第4天开始给药，1次/d，共17 d，正常对照组、模型组和阴性对照组给予等体积生理盐水，低、高剂量药物组分别灌胃给予60、240 mg/kg TSCS，阳性药物组腹腔注射25 mg/kg色甘酸钠，于第20天处死小鼠，取血样和关节组织。

1.2.3 关节肿胀度及关节炎评分致炎前、致炎后第4、8、12、16、20天，采用游标卡尺测量小鼠足踝关节厚度，根据足踝关节红肿程度进行评分，评分标准：0分：无红肿；1分：1个足踝关节红肿；2分：2个足踝关节红肿；3分：3个足踝关节红肿；4分：4个足踝关节红肿。

1.2.4 关节组织形态学观察关节组织固定脱钙，常规石蜡包埋制片，HE染色，光学显微镜下观察组织病理改变。根据关节周围组织中性粒细胞浸润（炎症）程度、边缘带血管翳（血管翳）、骨侵蚀及软骨破坏情况进行评分［5］。

1.2.5 滑膜组织MC及脱颗粒观察石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，甲苯胺蓝（TB）染色，光学显微镜下观察MC形态并计数。脱颗粒率（%）=脱颗粒MC数/MC总数×100%。

1.2.6 免疫组化检测滑膜组织Tryptase、PAR‐2表达石蜡切片经常规脱蜡水化，微波修复抗原，3%H2O2处理灭活内源性过氧化物酶，5% BSA室温封闭30 min，滴加一抗，4℃孵育过夜，滴加二抗，孵育1 h，DAB显色，苏木素染液复染，封片，显微图像分析系统定量分析图像。

1.2.7 血清抗体及关节组织炎症因子检测采用ELISA试剂盒检测血清IgG及关节组织Tryptase、TNF‐α、IL‐6、IL‐17、PGE2含量变化。

1.2.8 qRT‐PCR检 测 关 节 组 织Tryptase、PAR‐2 mRNA表达取液氮冻存小鼠炎症足跖关节制备组织匀浆，提取总RNA。采用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参，引物序列见表1，采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR扩增，检测Tryptase、PAR‐2 mRNA表达。

1.3 统计学处理采用GraphPad Prism 6.01软件进行统计学分析。数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠关节肿胀度及关节炎评分与阴性对照组相比，移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠注射K/B×N小鼠血清后出现关节炎症状。与模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组小鼠关节肿胀度和关节炎评分明显降低（P＜0.05），TSCS低剂量组小鼠关节肿胀度及关节炎评分差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

2.2 各组小鼠关节组织病理变化及评分HE染色结果如图2所示，与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠关节间隙消失，滑膜中有明显炎症细胞浸润，并伴有骨及软骨破坏；与WT模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组小鼠关节间隙清晰，炎症细胞浸润明显改善，骨及软骨破坏程度明显减轻；TSCS低剂量组小鼠关节间隙减小，滑膜中炎症细胞浸润程度、骨及软骨的破坏程度均较WT模型组有所降低。各组病理学评分分析发现，与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠各项评分升高；与WT模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组各项评分均显著降低（P＜0.01），而TSCS低剂量组各项评分变化无统计学意义（P＞0.05，图3）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

图1 各组小鼠关节肿胀度及关节炎评分Fig.1 Joint swelling degrees and arthritis scores of mice in each group

图2 各组小鼠关节组织HE染色（×200）Fig.2 HE staining of joint tissue of mice in each group（×200）

2.3 各组小鼠关节组织肥大细胞脱颗粒变化TB染色结果见图4，与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠关节组织MC脱颗粒数较多，脱颗粒率较高；与WT模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组小鼠关节组织MC脱颗粒数显著减少，脱颗粒率降低（P＜0.01），TSCS低剂量组小鼠关节组织MC脱颗粒率差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组小鼠关节组织病理学评分Fig.3 Histopathological scores of joints of mice in each group

图4 各组小鼠关节MC脱颗粒情况（×100）Fig.4 Degranulation of joint MC of mice in each group（×100）

图5 各组小鼠关节组织Tryptase表达（×200）Fig.5 Expression of Tryptase mRNA in joint tissues of mice in each group（×200）

图6 各组小鼠关节组织PAR‐2表达（×200）Fig.6 Expression of PAR‐2 in joint tissues of mice in each group（×200）

2.4 各组小鼠关节组织Tryptase蛋白和mRNA表达与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠关节组织Tryptase蛋白及mRNA表达升高；与WT模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组Tryptase蛋白及mRNA表达降低（P＜0.01），TSCS低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见图5。

2.5 各组小鼠关节组织PAR‐2蛋白和mRNA表达与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠关节组织PAR‐2蛋白及mRNA表达升高；与WT模型组相比，TSCS高剂量组、色甘酸钠治疗组小鼠PAR‐2蛋白及mRNA表达降低（P＜0.05），TSCS低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见图6。

图7 各组小鼠血清IgG及关节组织炎症因子水平Fig.7 Levels of serum IgG and joint tissue inflammatory factors of mice in each group

2.6 各组小鼠血清ⅠgG及关节组织炎症因子水平与W‐4Bao阴性对照组相比，WT模型组小鼠血清中IgG、关节组织Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含 量升高；与WT模型组相 比，TCSC高 剂量组、色甘酸钠治疗组小鼠血清中IgG、关节组织Tryptase、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2含量显著降低（P＜0.05），TSCS低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。

3 讨论

K/B×N小鼠关节炎模型作为最常用的基因修饰小鼠模型之一，是RA研究的重要工具。该模型与RA的临床组织学特征相似，均有白细胞浸润、滑膜炎、血管翳生成、关节软骨和骨的破坏等特征，且发病严重、迅速，在遗传背景相同的动物中发病率为100%［6］。K/B×N小鼠来自KRN‐T细胞受体转基因小鼠与NOD小鼠杂交F1代，在4～5周龄自发产生严重的关节炎，将K/B×N小鼠血清注射到正常小鼠如BALB/c、C57BL/6小鼠体内，可在较短时间内诱发关节炎［7］。因此，本研究采用K/B×N小鼠血清转移性关节炎模型研究TSCS治疗RA的作用机制。

研究发现MC与多种自身免疫性疾病的发生联系密切［8‐9］。RIVELLESE等［10］分析MC在治疗早期RA患者滑膜中的存在以及其与滑膜炎组织学特征的关联和功能关系发现，早期RA患者滑膜MC数较高，且与局部和全身炎症、自身抗体阳性率和较高的疾病活动度有关，提示MC参与RA发病过程。研究发现，MC通过自身抗体IgG/FcγR介导的活化可产生大量炎症因子，如IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、组胺和Tryptase等，且以脱颗粒方式释放到细胞外，进而导致关节炎［11］。Tryptase是MC的特异性标志物，在胞内含量最多，其在MC中的储存和表达具有高度选择性，可作为MC激活及脱颗粒的标志物［12］。

滑膜组织的主要组成细胞是成纤维样滑膜细胞（fibroblast‐like synoviocytes，FLS），FLS凋亡减少与RA滑膜增生密切相关［13］。体外实验发现，FLS对Fas凋亡途径高度敏感［14］。尽管凋亡因子Fas在RA滑膜组织中高表达，FLS仍然高度增殖，提示RA滑膜组织中存在抑制FLS凋亡的机制［15］。研究发现，MC脱颗粒释放的Tryptase在抑制FLS凋亡的过程中发挥重要调控作用，Tryptase通过与表达于FLS细胞膜上的PAR‐2相互作用，激活PAR‐2偶联的G蛋白Rho信号转导途径抑制FLS凋亡［16‐17］。同时，FLS释放干细胞生长因子（stem cell factor，SCF），通过与表达在MC上的SCF受体C‐kit结合，维持MC增殖活化，共同构成MC‐FLS双信号自身放大系统，促进RA发生发展［18］。因此，MC的持续活化可能是抑制RA成纤维样滑膜细胞凋亡、促进其增殖、引起关节破坏的关键，提示抑制MC活化有望成为RA治疗的途径［19］。

课题组前期体外实验发现，TSCS可显著抑制不同抗原刺激的MC活化脱颗粒［20］。Tryptase可通过与表达在FLS胞膜上的PAR‐2相互作用，进而激活PAR‐2偶联的G蛋白Rho信号，抑制FLS凋亡，给予PAR‐2拮抗剂处理后可显著降低Tryptase对FLS的抗凋亡作用［16］。

本研究采用MC C‐kit基因正常型C57BL/6小鼠和MC C‐kit基因缺陷型KitW‐4Bao小鼠以及过继移植BMMC的KitW‐4Bao小鼠进行体内实验，探究TSCS对K/B×N小鼠血清转移性关节炎的治疗作用，结果表明，MC参与K/B×N小鼠血清转移性关节炎发病过程，TSCS可明显降低关节炎小鼠关节肿胀度、关节炎评分、病理学评分、滑膜组织MC脱颗粒率、滑膜组织Tryptase和PAR‐2蛋白和mRNA、IL‐6、IL‐17、TNF‐α、PGE2、血清IgG表达，对K/B×N小鼠血清转移性关节炎具有治疗作用，其机制可能与TSCS抑制MC活化脱颗粒释放Tryptase，进而影响MC‐Tryptase‐PAR‐2‐FLS途 径，抑 制 滑 膜FLS增殖有关，与课题组前期体外实验结果一致，为以MC为靶点的新型抗RA药物的研发提供依据。