CD4+T细胞迁移在哮喘小鼠“肺合大肠”的初探①

孔靖玮 李亚兰 吴珺 葛东宇 刘红双 赵点 彭桂英

（北京中医药大学生命科学学院，北京 100029）

“肺与大肠相表里”理论源于“脏腑相合”理论，是藏象学说的关键组成部分，在中医药临床工作中具有重要的指导意义［1］。《黄帝内经》最早提出“肺合大肠”理论，近年来，关于该理论的研究十分广泛。课题组前期研究发现“从肠治肺”方大承气汤能有效改善哮喘小鼠的肺部炎症［2‐3］。另有实验指出哮喘等肺系疾病动物模型伴有不同程度的肠道功能障碍和病理损伤，同时引起肠道内炎性介质、神经肽等物质的变化［4‐7］。此外，Science曾报道在蠕虫感染后，肠源性KLRG1+ILC2可迁移至肺部产生免疫应答［8］，这些结果均表明肺与大肠之间存在一定的生物学联系，然而免疫细胞从肺组织迁移至肠道的相关内容尚未见报道。

免疫细胞再循环与归巢是维持机体正常免疫状态的关键因素，细胞可通过血管和淋巴管在器官和组织中循环或定植。联体共生模型是目前检测细胞是否具有迁移功能最直接、最有效的方法［9］。该模型将两只实验动物的相邻皮肤进行手术缝合，随着缝合处血管重塑与血液互通，共生鼠可共用一套血液循环系统，通过特异性标记可检测组织中细胞的迁移能力。因此，本研究拟借助于同类系小鼠构建联体共生模型，对哮喘小鼠肺组织CD4+T细胞迁移至结肠的可能性进行探讨，同时探索联体共生小鼠模型的构建方法，为后续“脏腑相合”理论的深入研究提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物SPF级，6～8周龄C57BL/6雌性小鼠（基因型为CD45.2），体重18～20 g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK（京）2016‐0002。CD45.1小鼠由清华大学免疫研究所惠赠，繁殖饲养于北京中医药大学实验动物中心。小鼠自由进食饮水，12 h明暗周期，温度（22±2）℃，相对湿度（50±10）%。

1.1.2 试剂木瓜蛋白酶（papain）、BSA购自Sig-ma；新霉素、多黏菌素‐B购自INALCO；酮咯酸氨丁三醇购自源叶生物；PBS、D‐Hank′s、红细胞裂解液购自索莱宝；RPMI1640购自HyClone；胶原酶Ⅲ购自Worthington；Percoll分离液购自GE Healthcare；小鼠流式抗体：CD16/CD32、CD45‐Pacific BlueTMdye、CD3‐FITC、CD4‐AlexaFlourTM700、CD45.2‐Briliant Violet 510、CD11b‐PE‐Cy5、CD11c‐FITC、CD170（Si-glec‐F）‐PE、Ly6C‐APC/Cyanine7、Ly6G‐APC购自Bio-Legend；CD8a‐PE购自BD PharmingenTM；CD45.1‐PE‐Cyanine7购自eBioscienceTM。

1.1.3 仪器超分辨显微组织成像显微镜（Lecia，Aperio Versa）；流式细胞仪（Beckman Coulter，Cyto-FLEX）。

1.2 方法

1.2.1 联体共生小鼠模型的制备选择周龄、体格、体重相近的CD45.1和CD45.2雌性小鼠各10只进行配对，术前配对小鼠单独合笼适应性饲养2周。手术当天，通过腹腔注射0.5%戊巴比妥溶液麻醉小鼠，剔除2只小鼠相对一侧的毛发，碘伏消毒后行无菌手术，切开从肘部至膝盖的皮肤，将距切口0.5 cm的皮肤与皮下筋膜剥离，接着将两只小鼠切口行连续缝合术。术中皮下注射生理盐水防止脱水并肌肉注射1 mg/ml酮咯酸氨丁三醇溶液镇痛，术后每日进行手术切口消毒，并给予酮咯酸氨丁三醇镇痛，使用含抗生素（106U/L多黏菌素B+1.1 g/L新霉素）的饮用水2周以预防感染。2周后取小鼠尾尖血，通过流式细胞术检测血液循环构建情况，术后4周进行分组与造模，实验过程见图1。

1.2.2 实验分组与造模成功构建的联体共生小鼠，随机分成2组，对照组（Control）和模型组（Mod-el），每组各3对。模型组中CD45.1小鼠给予papain滴鼻诱发哮喘，哮喘的诱发方案如下，于第0、1、3、4、5天在小动物麻醉机作用下30µg/40µl papain滴鼻，每日1次；对照组中CD45.1小鼠给予无菌PBS溶液相同处理，两组中的CD45.2小鼠均无处理。

1.2.3 肺泡灌洗液（BALF）提取与细胞的制备最后一次滴鼻24 h后，麻醉下处死小鼠。解剖分离气管和主支气管，左主支气管行结扎后，以1 ml注射器插入右主支气管，用0.8 ml无菌PBS溶液连续灌洗右肺3次，回收率为80%以上，回收灌洗液离心后收集细胞沉淀，重悬于含0.5%BSA的PBS溶液中计数，取1×106个细胞用流式细胞术检测中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的数量。

图1 同类系小鼠构建联体共生模型的实验方案Fig.1 Experimental protocol of parabiotic model by con-genic mice

1.2.4 肺组织和结肠组织单细胞悬液的制备提取小鼠右肺组织，用组织剪将其剪碎，置于含1 mg/ml胶原酶Ⅲ的RPMI1640溶液中37℃消化60 min后，消化液经70µm的细胞筛过滤后，离心收集细胞沉淀，经冷PBS洗涤2次后，重悬于40%Per-coll分离液中。

提取小鼠结肠组织，将组织剪成5 mm×5 mm×5 mm组织块后用含5 mmol/L EDTA的D‐Hank's洗涤2次，每次20 min，接着置于1 mg/ml胶原酶Ⅲ的RPMI1640溶液中37℃消化60 min后，消化液经70 µm的细胞筛过滤后，离心收集细胞沉淀，经冷PBS洗涤2次后，重悬于40%Percoll分离液中。

将前两步获得的肺和结肠组织的40%Percoll细胞悬液进行梯度离心，沉淀细胞用红细胞裂解液裂解，冷PBS洗涤2次，重悬于含0.5%BSA的PBS溶液中计数，并取1×106个细胞用于后续流式细胞术检测。

1.2.5 HE染色检测肺组织和结肠组织病理学变化取左肺组织，用10%甲醛溶液固定24 h。提取结肠组织，将结肠按照Swiss‐roll方式翻卷成年轮状后，用10%甲醛溶液固定24 h。梯度酒精脱水、透明，石蜡包埋，制备5～6µm组织切片用于HE染色，封片后超分辨显微组织成像显微镜下拍照，观察肺组织和结肠组织的病理学变化。

1.2.6 流式细胞术检测免疫细胞的表型前述制备的组织单细胞悬液，首先加入CD16/CD32抗体冰上孵育10 min；对于BALF中嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的检测，加入荧光素标记的anti‐mouse CD45、anti‐mouse CD11b、anti‐mouse CD11c、anti‐mouse Singlec‐F、anti‐mouse Ly6G以 及anti‐mouse Ly6C等抗体，冰上避光孵育30 min；对于肺肠组织的T细 胞 检 测，加 入anti‐mouse CD3、anti‐mouse CD4、anti‐mouse CD8、anti‐mouse CD45、anti‐mouse CD45.1、anti‐mouse CD45.2等抗体冰上避光孵育；最后用含0.5%BSA的PBS洗涤2次后重悬，待上机检测。框门策略：①CD4+T细胞：CD45+CD3+CD4+；②CD8+T细胞：CD45+CD3+CD8+；③嗜酸性粒细胞（Eo-sinophil）：CD45+CD11b+CD11c‐Singlec‐F+；④中 性粒细 胞（Neutrophil）：CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cinter；⑤CD45.1+CD4+T细 胞：CD45+CD45.1+CD3+CD4+；⑥CD45.2+CD4+T细胞：CD45+CD45.2+CD3+CD4+。

1.3 统计学方法实验数据采用SPSS16.0软件进行统计分析，以±s表示，方差齐采用独立样本t检验，方差不齐采用近似t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 木瓜蛋白酶可诱发哮喘小鼠肺部炎症对木瓜蛋白酶滴鼻诱发小鼠哮喘模型进行分析。肺组织HE染色结果显示PBS滴鼻小鼠肺泡壁结构完整，气管周围未见炎症细胞浸润，而给予小鼠papain滴鼻，其支气管及血管周围存在明显炎症细胞浸润，部分肺泡结构消失（图2）。流式细胞术结果显示小鼠经papain滴鼻后BALF中嗜酸性粒细胞（P＜0.001）与嗜中性粒细胞（P＜0.01）数量均显著升高（图3），且肺组织CD4+细胞的比例也明显升高（P＜0.001，图4）。

2.2 木瓜蛋白酶诱发哮喘小鼠存在结肠组织炎症细胞浸润按照Swiss‐roll法将结肠卷成年轮状，制备结肠全肠的病理切片，HE染色结果显示PBS滴鼻小鼠结肠黏膜组织结构完整，黏膜层、黏膜下层和肌层无炎症细胞浸润，但papain滴鼻小鼠结肠黏膜层多处可见炎症细胞浸润，黏膜下层、肌层无明显病理改变（图5）。这说明哮喘小鼠存在结肠组织炎性病变，可能存在肠道功能的紊乱。

图2 小鼠肺组织HE染色（×100）Fig.2 HE staining of lung tissues in mice（×100）

图3 小鼠BALF中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数量Fig.3 Counts of eosinophils and neutrophils in BALF of mice

2.3 流式细胞术分析小鼠结肠CD4+T细胞比例在木瓜蛋白酶诱导的哮喘小鼠结肠黏膜固有层中，CD4+T细胞比例明显高于PBS滴鼻小鼠（图6），说明在哮喘状态下，CD4+T细胞比例在肺组织和结肠组织中发生了一致性的变化。

2.4 联体共生模型的构建及一般情况本研究采用的同类系小鼠CD45.1和CD45.2，除了在CD45分子的表达有差异外，遗传背景完全相同。可借助于这种工具鼠进行免疫细胞的来源与分化等研究。

本实验共构建了10对联体共生小鼠，其中术后2对拖拽严重、动作不协调，1对伤口脱线，1对手术后体型出现明显差异，手术成功率为60%，因此本研究拟对余下的6对小鼠进一步造模研究。手术2周后流式细胞术检测小鼠血液交换情况，结果显示这6对联体共生小鼠血液内CD45.1+细胞和CD45.2+细胞的占比差异不显著（P＞0.05），白细胞交换比例接近50∶50（图7），表明此6对共生小鼠构建成功，二者可共享血液循环系统。接着将这6对联体共生小鼠随机分成对照组和模型组，每组3对，按照前述方法造模。

图4 小鼠肺组织CD4+T细胞的比例Fig.4 Proportion of CD4+T cells in lung tissues of mice

图5 小鼠结肠组织HE染色（×100）Fig.5 HE staining of colon tissues in mice（×100）

图6 小鼠结肠黏膜固有层CD4+T细胞的比例Fig.6 Proportion of CD4+T cells in colonic lamina pro-pria of mice

2.5 哮喘状态下共生鼠结肠黏膜固有层CD4 5.1+CD4+T细胞的变化利用同类系CD45.1和CD45.2的标记，将CD4+T细胞进一步分析，发现来源于CD45.1小鼠的CD4+T细胞比例发生了变化。CD45.2小鼠结肠中CD45.1+CD4+T细胞比例显著升高（P＜0.05，图8）。推测模型组中CD45.2小鼠结肠内增加的CD45.1+CD4+T细胞应是CD45.1小鼠肺部受到木瓜蛋白酶刺激后，体内CD4+T细胞扩增迁移而来，这群扩增迁移而来的CD4+T细胞具体亚群值得进一步研究。

图7 流式细胞术检测联体共生模型血液交换情况Fig.7 Flow cytometry analysis of blood exchange in para-biotic model

图8 流式细胞术检测两组共生小鼠结肠黏膜固有层CD45.1+CD4+T细胞的比例Fig.8 Flow cytometry analysis of proportion of CD45.1+CD4+T cells in colonic lamina propria of each mouse in parabiotic model

3 讨论

“肺合大肠”理论首见于《黄帝内经》，《灵枢·本输》曰：“肺合大肠，大肠者，传道之府。”肺与大肠互为表里，在经络上相互联系，在生理和病理上相互影响，虽然肺组织与肠道在解剖学结构上存在一定的距离，但有大量实验证明了肠道与肺之间的生物学联系。如肠道菌群对肺部疾病发生与转归的影响，黏膜系统免疫应答的相互调控，细胞因子的内分泌作用等［10］。由此可见，中医基础理论“肺合大肠”的科学内涵在不断丰富。

哮喘是一种以支气管痉挛和气道炎症为主要特征的常见肺系疾病，发病时有多种免疫细胞参与［11］。本研究以哮喘为疾病模型，借助于联体共生模型探寻肺与大肠之间是否存在特异性免疫细胞的迁移。木瓜蛋白酶是一种自然界中常见的过敏原，研究表明papain诱导的哮喘小鼠气道周围存在白细胞浸润、杯状上皮化生、黏液增多、气道狭窄等病理改变［12］。本研究发现，papain滴鼻小鼠与PBS滴鼻小鼠相比，其BALF中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数量明显增多，同时肺组织CD4+T细胞比例显著升高。这与文献报道OVA诱发小鼠哮喘模型一致，提示papa-in滴鼻能成功构建哮喘模型，促进肺组织CD4+T细胞的增殖分化［13］。值得注意的是，papain滴鼻诱发的哮喘小鼠结肠黏膜层有明显的炎症细胞浸润以及CD4+T细胞比例的增加，提示哮喘发病可能影响肠道免疫状态，造成一定程度的肠道组织损伤。有研究报道OVA诱导的小鼠哮喘模型可发生IFN‐γ介导的结肠炎症病变，此外，烟草吸入可通过Th17细胞‐中性粒细胞轴诱发肠道炎症［6‐7］。这与本研究结果初步一致，然而papain诱发的哮喘小鼠结肠组织炎症病理是否和CD4+T细胞组织迁移的特异性有关尚不明确，因此，本研究进一步采用联体共生模型对CD4+T细胞在肺与大肠之间迁移的可能性进行探讨。

联体共生鼠模型应用于多类基础研究，通过特异性标记可检测小鼠组织内本体细胞与配体细胞（对侧动物）的分布状态，具有迁移特性的细胞会以同样的概率分布于对侧动物组织中，而组织驻留细胞则不随血液循环迁移。联体共生模型构建周期较长，代价较大，成功建立模型是实验最关键的步骤之一。在模型构建过程中，课题组发现配对小鼠生理指标和生活习性的一致性十分重要，若重量、体格差异较大，易导致拉扯、脱线，使伤口愈合较差影响血液交换，若配对小鼠生活习性不一致，易导致动作不协调，进而出现进水进食困难、脱线等问题。解决上述问题后，配合熟练的手术操作可稳定构建共享循环的联体共生鼠，用于从细胞的迁移性寻找脏腑之间关联的研究。

本研究结果发现，在对照组中的CD45.2小鼠结肠黏膜固有层CD4+T细胞中，CD45.1+CD4+T细胞占比约为40%，表明部分CD4+T细胞在生理状态下可迁移募集至肠道，但这种分布状态在模型组中发生了显著变化，CD4+T细胞中CD45.1+CD4+T细胞占比接近55%。在本实验中仅对联体共生鼠中的CD45.1小鼠进行滴鼻，检测CD45.2小鼠体内CD45.1+细胞的分布可以更直接地观察在哮喘疾病模型下免疫细胞的迁移。在CD45+CD3+CD4+框门下，CD45.1+细胞比例明显高于对照组，说明未受刺激的CD45.2小鼠结肠内增加的CD45.1+CD4+T细胞由CD45.1小鼠体内迁移而来，考虑到木瓜蛋白酶能够激活肺部CD4+T细胞增殖，其直接作用于CD45.1小鼠肺组织，推测哮喘状态下肺内增殖的CD45.1+CD4+T细胞迁移能力增强，经循环可能募集至结肠黏膜固有层。CD4+T细胞亚型众多，上述发生迁移的CD4+T细胞更可能是CD45.1小鼠体内某个CD4+T细胞亚群。

综上所述，研究结果表明木瓜蛋白酶诱导的哮喘小鼠存在结肠组织炎症病理改变，且体内CD4+T细胞亚群可特异性迁移到结肠黏膜固有层，这丰富了“肺合大肠”的科学内涵。然而，这群特异性迁移至肠道的CD4+T细胞到肠道发挥怎样的作用，其具体表型如何，以及迁移归巢方式，值得深入探讨。