橙皮素调控miR‐182‐5p对口腔鳞癌BcaCD885细胞迁移和分泌IL‐6、IL‐8的影响

王超 马旭亮 程瑞卿 张晶晶 杨莉（河北省眼科医院口腔种植科，邢台 054001）

口腔鳞癌是常见头颈部恶性肿瘤，患病人群趋于年轻化，给人类的生命健康带来巨大危害，虽然近些年关于口腔鳞癌的研究越来越多，但口腔鳞癌患者的生存率却没有得到明显改善［1］。口腔鳞癌的发生除了与癌细胞恶性生长、转移有关以外，还与肿瘤微环境有关，肿瘤细胞能够分泌炎症因子，加快肿瘤进程［2］。橙皮素是一种黄酮类的化合物，在花卉、水果、食品等物质中广泛存在，具有生物及药理学活性［3］。橙皮素具有降低胆固醇、改善糖尿病肾病、治疗痤疮、保护神经等功能［4］。有研究发现，橙皮素还具有抗肿瘤功效，体外能够抑制结直肠癌、食管癌、前列腺癌等肿瘤细胞生长，对肿瘤细胞EMT、迁移和侵袭能力有抑制作用［5‐7］。对舌癌的研究显示，橙皮素处理后的舌癌细胞增殖能力降低，细胞周期被阻滞［8］。目前尚不明确橙皮素对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭、EMT以及分泌IL‐6、IL‐8的作用。miR‐182‐5p是一个与肿瘤有关的小分子RNA，在人体组织中具有多种生物学作用，其在口腔癌中表达上调，能够诱导肿瘤进展，miR‐182‐5p被认为是肿瘤发生过程中的促进因子［9］。本次实验探讨橙皮素调控miR‐182‐5p对口腔鳞癌细胞迁移、侵袭、EMT以及分泌IL‐6、IL‐8的影响，为橙皮素治疗口腔鳞癌的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料橙皮素购自成都德思特生物技术有限公司；E‐cadherin抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；N‐cadherin抗体购自美国Proteintech；IL‐8含量测定试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；Vi-mentin抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；miR‐182‐5p mimics、mimics control购自上海吉玛制药技术有限公司；IL‐6含量测定试剂盒购自杭州赛基生物科技有限公司；MMP‐9抗体购自美国GeneTex。

1.2 方法

1.2.1 CCK‐8检测橙皮素对口腔鳞癌BcaCD885细胞增殖的影响口腔鳞癌BcaCD885细胞接种到96孔板，接种密度为3 000个细胞/孔，置37℃，5%CO2培养箱中培养过夜，将上清溶液弃掉，细胞分成2组，分别为Control组和Hesperidin组，Control组为0µmol/L橙皮素作用组，Hesperidin组又分成4个浓度梯度，分别为20、40、80、160 µmol/L橙皮素作用组，继续培养24 h。将培养板取出，将孔中的液体吸弃，添加100 µl的细胞培养液和10 µl的CCK‐8溶液，均匀混合，置于37℃培养4 h。将酶标仪波长调整为450 nm，检测每个孔的OD值。常规方法计算细胞存活率。

1.2.2 Transwell小室检测橙皮素对BcaCD885细胞迁移和侵袭的影响将Control组和Hesperidin组（40、80、160 µmol/L）BcaCD885细胞悬浮在不含血清的细胞培养液中备用。细胞侵袭实验前以基质胶湿化小室，步骤如下：将基质胶4℃融化，用不含血清的DMEM稀释，每孔中加入100µl稀释后的基质胶，37℃孵育2 h。其余实验步骤均相同，简述如下：吸取细胞溶液添加到小室的上室中，每孔200µl，在下室中添加含有10%胎牛血清的细胞培养液500µl。置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。用棉签把没有穿膜的细胞擦掉，用4%的多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。在显微镜下计数细胞穿膜数目。

1.2.3 Western blot检 测 橙 皮 素 对BcaCD885细 胞中E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表达的影响分别取培养24 h后的Control组和Hes-peridin组（40、80、160 µmol/L）BcaCD885细胞，用PBS洗涤，添加RIPA溶液（按照1∶100比例添加PMSF），置于冰上反应5 min，快速振荡10 s，重复该过程5次。4℃，10 000 g离心10 min。吸取上清溶液，分装备用。按照BCA方法对蛋白浓度进行分析。此次实验选择10%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS‐PAGE电泳。在蛋白样品中添加2×Loading Buffer溶液，放在100℃孵育5 min。每孔中添加40µg的蛋白样品，首先以70 V的电压电泳30 min，然后换成100 V继续电泳1.5 h。将NC膜按照凝胶的大小进行裁剪，以300 mA的恒流转膜90 min。将NC膜放在5%牛血清白蛋白溶液中，室温结合2 h。将NC膜放在1∶1 000稀释后的一抗溶液中，4℃环境中结合过夜。再将NC膜放在1∶4 000稀释后的二抗溶液中，室温结合1 h。采用ECL化学发光显色液进行显影。Im-age J分析条带的灰度值，以β‐actin作为内参，分析目的蛋白相对表达变化。

1.2.4 ELⅠSA法检测橙皮素对BcaCD885细胞分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影响分别取培养24 h后的Control组和Hesperidin组（40、80、160µmol/L）BcaCD885细胞培养液上清，以ELISA法检测IL‐6、IL‐8水平，步骤分别参照IL‐6、IL‐8含量测定试剂盒说明书进行。

1.2.5 qRT‐PCR法检测橙皮素对BcaCD885细胞中miR‐182‐5p表达的影响分别取培养24 h后的Control组 和Hesperidin组（40、80、160 µmol/L）BcaCD885细胞，按照107个细胞中添加1 ml的Trizol试剂分别提取细胞中的总RNA。用灭菌的双蒸水调节紫外分光光度计的准确性，添加样品，检测OD260/OD280的比值（在1.8～2.0之间）。利用PrimeScript RT reagent Kit进行逆转录反应，取1 µg的RNA，加 入2 µl的gDNA Eraser Buffer、1 µl的gDNA Eraser，最后添加RNase Free water至10 µl，42℃孵育2 min，4℃孵育5 min，继续在上述溶液中加入1 µl的PrimeScript RT Enzyme mixⅠ、4 µl的5×PrimeScript Buffer 2、1 µl的RT Primer mix、10 µl的Reaction solution，最后添加RNase Free water至30µl，放在37℃孵育15 min，85℃孵育5 s，4℃备用。以SYBR Premix Ex TaqⅡ进行PCR反应，取2 µl的cDNA，加 入0.5 µl的Reverse primer和Forward primer、5 µl的SYBR Green PCR Master mix，添 加RNase Free water至10 µl，95℃孵育10 s，55℃孵育30 s，72℃孵育30 s。U6为内参，按照2-ΔΔCT法计算miR‐182‐5p的表达水平。miR‐182‐5p F：5′‐GGGT‐TTGGCAATGGTAGAACTCA‐3′，R：5′‐CCAGTGA‐CGGGTCCGAGGT‐3′；U6 F：5′‐CTCGCTTCGAGCG-CACA‐3′，R：5′‐AACGTTTCACGAATTTGCGT‐3′。

1.2.6 细胞转染及逆转作用BcaCD885细胞中分别转染miR‐182‐5p mimics、mimics control（转染步骤参照转染试剂Lipofectamine®2000进行），然后用含80 µmol/L橙皮素细胞培养液培养24 h，记为Hes-peridin+miR‐182‐5p和Hesperidin+miR‐NC组，分别测定细胞增殖（步骤参照1.2.1中CCK‐8法）、迁移、侵袭（步骤参照1.2.2中Transwell小室法）和E‐cad-herin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表达（步骤参照1.2.3中Western blot法）以及细胞分泌IL‐6、IL‐8水平（步骤参照1.2.4中ELISA法）。

1.3 统计学分析用SPSS21.0分析统计实验数据，以±s表示，两组数据间比较使用t检验，多组差异比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 橙皮素对BcaCD885细胞增殖的影响与0 µmol/L橙皮素处理的Control组比较，20 µmol/L橙皮素处理后的BcaCD885细胞存活没有变化，而40、80、160 µmol/L橙皮素处理后的细胞存活率降低，选择40、80、160 µmol/L橙皮素进行后续实验。见表1。

2.2 橙皮素对BcaCD885细胞迁移、侵袭和EMT的影响与0µmol/L橙皮素处理的Control组比较，40、80、160 µmol/L橙皮素处理后的细胞迁移和侵袭数目依次降低，细胞中E‐cadherin蛋白表达水平依次升高，细胞中Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平依次降低。橙皮素抑制口腔鳞癌BcaCD885细胞迁移、侵袭和EMT。见图1和表2。

2.3 橙皮素对BcaCD885细胞分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影响与0 µmol/L橙皮素处理的Control组比较，40、80、160µmol/L橙皮素处理后的细胞分泌IL‐6、IL‐8依次减少。橙皮素抑制BcaCD885细胞分泌IL‐6、IL‐8。见表3。

2.4 橙皮素对BcaCD885细胞中miR‐182‐5p表达的影响与0µmol/L橙皮素处理的Control组比较，40、80、160µmol/L橙皮素处理后的细胞中miR‐182‐5p水平依次减少。橙皮素下调BcaCD885细胞中miR‐182‐5p的表达水平。见表4。

表1 橙皮素处理后BcaCD885细胞存活率(±s)Tab.1 Survival rate of BcaCD885 cells treated with hes-peretin(±s)

表1 橙皮素处理后BcaCD885细胞存活率(±s)Tab.1 Survival rate of BcaCD885 cells treated with hes-peretin(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05.

Groups Survival rate（%）100.00±9.52 96.32±8.21 80.23±6.941）68.52±5.111）50.31±4.281）20.068＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin concentra-tion（µmol/L）0 20 40 80 160 F P

图1 Western blot检测橙皮素处理后BcaCD885细胞中E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平Fig.1 Western blot detection of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 protein levels in BcaCD885 cells treated with hesperetin

表2 橙皮素处理后BcaCD885细胞迁移数目、侵袭数目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平(±s)Tab.2 Number of migration，invasion and protein levels of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 of CD885 cells after hesperetin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40µmol/L，2）P＜0.05；compared with 80µmol/L，3）P＜0.05.

Groups Number of migrations Number of invasion E‐cadherin Vimentin N‐cadherin MMP‐9 0.68±0.08 0.50±0.061）0.36±0.031）2）0.24±0.041）2）3）103.200＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin concentration（µmol/L）0 40 80 160 F P 186.63±17.45 163.22±14.171）126.89±10.201）2）90.10±8.851）2）3）93.600＜0.001 152.32±13.56 127.41±10.131）88.39±7.551）2）63.11±3.261）2）3）160.641＜0.001 0.23±0.02 0.30±0.031）0.42±0.041）2）0.53±0.041）2）3）140.267＜0.001 0.60±0.06 0.49±0.051）0.35±0.031）2）0.22±0.021）2）3）133.135＜0.001 0.55±0.04 0.38±0.031）0.30±0.021）2）0.20±0.031）2）3）207.395＜0.001

表3 橙皮素处理后BcaCD885细胞分泌IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.3 Levels of IL‐6 and IL‐8 secreted by BcaCD885 cells after hesperetin treatment(±s)

表3 橙皮素处理后BcaCD885细胞分泌IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.3 Levels of IL‐6 and IL‐8 secreted by BcaCD885 cells after hesperetin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40 µmol/L，2）P＜0.05；Compared with 80µmol/L，3）P＜0.05.

Groups IL‐6（ng/ml）IL‐8（ng/ml）0.56±0.05 0.43±0.031）0.34±0.041）2）0.26±0.031）2）3）101.034＜0.001 Control Hesperidin Hesperetin con-centration（µmol/L）0 40 80 160 F P 0.42±0.05 0.34±0.031）0.27±0.021）2）0.22±0.021）2）3）74.786＜0.001

表4 橙皮素处理后BcaCD885细胞中miR‐182‐5p的水平(±s)Tab.4 Level of miR‐182‐5p BcaCD885 cells after hesper-etin treatment(±s)

表4 橙皮素处理后BcaCD885细胞中miR‐182‐5p的水平(±s)Tab.4 Level of miR‐182‐5p BcaCD885 cells after hesper-etin treatment(±s)

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with 40µmol/L，2）P＜0.05；compared with 80µmol/L，3）P＜0.05.

miR‐182‐5p level 1.00±0.11 0.68±0.051）0.50±0.041）2）0.41±0.031）2）3）142.789＜0.001 Groups Control Hesperidin Hesperetin concentra-tion（µmol/L）0 40 80 160 F P

表5 miR‐182‐5p mimics转染和橙皮素处理后BcaCD885细胞中miR‐182‐5p水平、细胞存活率、迁移数目、侵袭数目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平以及细胞分泌的IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.5 miR‐182‐5p level，cell survival rate，migration number，invasion number and E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin，MMP‐9 in BcaCD885 cells after miR‐182‐5p mimics transfection and hesperetin treatment protein level and IL‐6 and IL‐8 levels secreted by cells(±s)

表5 miR‐182‐5p mimics转染和橙皮素处理后BcaCD885细胞中miR‐182‐5p水平、细胞存活率、迁移数目、侵袭数目和E‐cadherin、Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白水平以及细胞分泌的IL‐6、IL‐8水平(±s)Tab.5 miR‐182‐5p level，cell survival rate，migration number，invasion number and E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin，MMP‐9 in BcaCD885 cells after miR‐182‐5p mimics transfection and hesperetin treatment protein level and IL‐6 and IL‐8 levels secreted by cells(±s)

Note：Compared with Hesperidin+miR‐NC，1）P＜0.05.

Groups E‐cadherin Vimentin N‐cadherin MMP‐9 Hesperidin+miR‐NC Hesperidin+miR‐182‐5p t P miR‐182‐5p level 1.00±0.12 2.15±0.251）12.441＜0.001 Survival rate（%）100.00±11.63 186.94±17.491）12.418＜0.001 Number of migrations 125.42±11.36 147.20±10.021）4.314＜0.001 Number of invasion 87.96±6.33 114.85±9.621）7.005＜0.001 0.40±0.05 0.29±0.021）6.128＜0.001 0.32±0.02 0.41±0.041）6.037＜0.001 0.31±0.03 0.46±0.051）7.717＜0.001 0.35±0.04 0.51±0.071）5.954＜0.001 IL‐6（ng/ml）0.24±0.03 0.30±0.021）4.992＜0.001 IL‐8（ng/ml）0.32±0.03 0.40±0.041）4.800＜0.001

2.5 上调miR‐182‐5p对橙皮素调控BcaCD885细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和分泌ⅠL‐6、ⅠL‐8的影响与Hesperidin+miR‐NC组比较，Hesperidin+miR‐182‐5p组BcaCD885细胞中miR‐182‐5p水平升高，细胞存活率、迁移数目、侵袭数目均升高，细胞中E‐cad-herin蛋白表达水平减少，Vimentin、N‐cadherin、MMP‐9蛋白表达水平升高，细胞分泌的IL‐6、IL‐8增多。见表5和图2。

图2 Western blot检 测BcaCD885细 胞E‐cadherin、Vi-mentin、N‐cadherin和MMP‐9蛋白水平Fig.2 Western blot detection of E‐cadherin，Vimentin，N‐cadherin and MMP‐9 protein level in BcaCD885 cells

3 讨论

橙皮素广泛存在于自然界中的多种物质如水果、花卉，具有抗氧化、消炎、降血压等功效，对动脉粥样硬化、肺组织损伤等具有治疗作用［10］。有研究显示，橙皮素具有抗肿瘤作用，对结肠癌细胞迁移和侵袭有抑制作用，橙皮素治疗后的宫颈癌细胞EMT水平降低，细胞增殖能力降低［5，11］。在舌癌研究中发现橙皮素能够体外抑制舌癌细胞增殖，具有抗舌癌作用［8］。本实验显示，橙皮素处理后的口腔鳞癌细胞的增殖能力降低，说明橙皮素能够在体外抑制口腔鳞癌细胞的生长，这与之前的研究结果相一致。

肿瘤的转移是一个十分复杂的过程，不仅与细胞内多种基因的异常表达调控有关，还与肿瘤微环境有关［12‐13］。肿瘤细胞从原来的位置脱落以后，通过降解细胞外基质，迁移、侵袭至新的组织，形成新的病发灶，肿瘤细胞降解细胞外基质依赖于细胞外基质降解酶，其中基质金属蛋白酶的作用极为关键，MMP‐9属于基质金属蛋白酶家族成员之一，其在肿瘤中表达上调，能够促进肿瘤转移［14］。EMT是肿瘤发生转移的早期标志，EMT是指上皮细胞特征逐渐消失而表现出间质细胞特征的过程［15］。Vimen-tin、N‐cadherin是间质细胞标志蛋白，在肿瘤中过度表达；E‐cadherin是上皮细胞标志蛋白，在肿瘤中表达下调；Vimentin、N‐cadherin表达水平升高而E‐cadherin表达水平降低被认为是EMT的标志［16‐17］。肿瘤微环境是近年来的研究热点，包括众多细胞因子、免疫因子等，IL‐6、IL‐8是在口腔鳞癌中表达上调的促炎因子，口腔鳞癌细胞分泌IL‐6、IL‐8增多能够促进癌症转移［18‐19］。研究显示，橙皮素处理后的结肠癌HCT116细胞迁移和侵袭能力降低，细胞中的MMP‐9水平下降［5］。在宫颈癌中亦发现，橙皮素提高肿瘤细胞中E‐cadherin表达水平，抑制细胞EMT［8］。本实验发现，橙皮素处理后的口腔鳞癌细胞迁移和侵袭数目减少，细胞中Vimentin、N‐cad-herin、MMP‐9蛋白表达水平降低，E‐cadherin蛋白表达水平升高，说明橙皮素抑制口腔鳞癌细胞迁移、侵袭和EMT，这与其他研究结果相符，均说明橙皮素在肿瘤细胞恶性生物学行为中的抑制功效。同时本研究还显示，橙皮素能通过减少细胞分泌IL‐6、IL‐8而发挥抑制口腔鳞癌转移的功能。

虽然已经有很多研究发现橙皮素具有抗肿瘤作用，但目前对橙皮素抗肿瘤的作用机制尚不明确。本实验发现，橙皮素处理后的口腔鳞癌细胞中miR‐182‐5p表达水平降低，橙皮素作用机制可能与miR‐182‐5p有关。miR‐182‐5p定位在人类第7号染色体上，其首次发现于小鼠眼组织，参与视力、听力的发育，与脂肪肝、肿瘤等病理过程有关［20‐22］。miR‐182‐5p在肿瘤中表达上调，并且参与肿瘤细胞的增殖和转移过程。在口腔鳞癌中的实验发现，miR‐182‐5p表达上调能够促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，反 之，下 调miR‐182‐5p能 抑 制 肿 瘤 细 胞恶 性 表型［9，23］。本实验显示，上调miR‐182‐5p能够逆转橙皮素对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和分泌IL‐6、IL‐8的影响，这说明橙皮素通过下调miR‐182‐5p参与口腔鳞癌进展。

综上所述，橙皮素通过下调miR‐182‐5p表达而抑制口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭、EMT和分泌IL‐6、IL‐8，这为橙皮素治疗口腔鳞癌的临床应用提供了理论资料，为研究橙皮素抗肿瘤分子机制奠定了基础。本研究尚未分析橙皮素通过何种靶向机制影响口腔鳞癌进展，且没有在多株口腔鳞癌细胞中进行验证，我们将在后续实验中对这部分内容进行探讨。