柚皮素通过ROS/P38‐MAPK信号通路调控肺癌A549细胞增殖及凋亡①

张悦 姚宇 梁玉灵 王文军（西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，泸州 646000）

肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，是癌症死亡的首要原因［1］。虽然目前肺癌有多种治疗手段，但肺癌的5年总体生存率仍很低，选择手术治疗、放化疗、靶向治疗等常规治疗方法的患者预期生存率依旧差强人意［2］。目前研究表明，由于细胞增殖与凋亡的平衡被扰乱而导致肿瘤的形成，细胞过度增殖的重要原因是细胞凋亡受阻，细胞凋亡在许多疾病的正常发展和病理过程中起着至关重要的作用，凋亡的研究对肿瘤的防治有重要意义［3］。抗肿瘤药物可通过促进肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤恶化进展，同时还可影响肿瘤细胞放疗敏感性［4］。虽然化疗是目前临床上治疗肺癌的常用手段，但因其可产生耐药性和毒副作用［5］，导致多数患者无法完成有效的放化疗周期，所以应致力于研究新的预防和治疗肺癌的天然药物［6］。研究表明，如紫杉醇等天然药物对于抗肿瘤的治疗有着很好的疗效，所以，寻找新型抗肿瘤的天然药物意义重大［7］。柚皮素是天然柑橘类水果中最丰富的类黄酮之一，具有抑制乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌细胞生长的能力［8］。但是，目前柚皮素对肺癌细胞增殖及凋亡的相关研究较少，其调控机制尚不十分清楚，本研究旨在探讨柚皮素对A549细胞增殖及凋亡的影响，阐明其影响的可能机制，为柚皮素在临床上预防及治疗肺癌提供证据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及试剂A549细胞来源于西南医科大学中心实验室；柚皮素（货号HY‐N0100）、p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580（SB）（货号HY‐10256）购自MCE；胎牛血清（FBS）（货号141215）购自杭州天杭生物科技有限公司，DMEM高糖培养基（货号SH30022）购自HyClone；总超氧化物歧化酶（T‐SOD）测试盒（羟胺法）（货号A001‐1‐1）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）（货号A003‐1）购自南京建成；CCK‐8试剂盒（货号C0038）、Annexin V‐FITC凋亡检测试剂盒（货号AO2001‐02P‐G）购自天津三箭生物技术有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（货 号S0033）购 自Beyotime，GADPH（货 号ab37168）、Nrf2（货号#12721）、HO‐1（货号10701‐0‐AP）、NQO1（货号ab80588）、P‐P38（货号#4511）、P38（货号#8690）、Cleaved capase3（货号ab49822）购自Abcam；HRP‐Goat anti Rabbit（货 号AS1107）购 自ASPEN；RIPA总蛋白裂解液（货号AS1004）、BCA蛋白质浓度测定试剂盒（货号AS1086）、ECL化学发光检测试剂盒（货号AS1059）购自ASPEN。

1.1.2 主要仪器CO2恒温培养箱购自SHEL LAB，倒置显微镜购自OLYMPUS；酶标检测仪购自Diatek；流式细胞仪购自BD；离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将A549细胞置于含10%FBS的RPMI1640培养液中，孵育于37℃、5%CO2的培养箱，当细胞已长满培养瓶时，将培养瓶从培养箱中取出，用PBS洗涤2次。

1.2.2 CCK‐8法将细胞用胰蛋白酶消化，以10 000个/孔接种于96孔板中，孵育于37℃下CO2（5%）培养箱中24 h以贴壁，继续培养24 h后分别更换为100µl细胞样品分别对应的含有柚皮素（30、60、90、120µmol/L）的培养基，对照组更换为含溶剂的培养基，在每孔中加入10 µl CCK‐8溶液孵育2 h后使用酶标仪测定450 nm光吸收值以测定细胞活力。细胞存活率%=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%。

1.2.3 流式细胞术取对数生长期的A549细胞，在6孔板中培养，分别用（0、30、60、90、120µmol/L）柚皮素处理48 h后，再收集各组培养液于流式管中，用PBS洗涤1遍，然后加入胰酶消化细胞后再加入培养基终止消化；再收集各组细胞于上一步的流式管中，300 g离心5 min，弃去上清后加入1 ml PBS重新悬浮细胞，再300 g离心5 min，弃去上清，沉淀用300µl的Binding Buffer重悬，按照试剂盒操作说明检测细胞凋亡，采用流式细胞仪获得分析结果，实验重复3次。

细胞分组同上，按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH‐DA，使终浓度为10µmol/L。用PBS洗3遍，加入1 ml稀释好的DCFH‐DA，37℃孵育20 min，充分去除未进入细胞内的DCFH‐DA后，再加入1 ml HG培养基，显微镜下观察拍照或流式上机以检测ROS含量。

1.2.4 WST‐8法、TBA法细胞分组同上，用旋涡混匀器充分混匀，置于37℃恒温水浴40 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色，测各管吸光度值以检测SOD活性；用旋涡混匀器充分混匀，95℃沸水水浴40 min，取出后流水冷却，按3 500～4 000 r/min，离心10 min，于波长523 nm处测各管吸光度值以检测MDA含量，实验重复3次。

1.2.5 Western blot法取对数生长期的A549细胞，分别用（0、30、60、90、120µmol/L）柚皮素以及柚皮素120 µmol/L+SB（10 µmol/L）处理48 h后，收集各组细胞，用细胞总蛋白提取试剂（RIPA）裂解各组细胞提取总蛋白，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；将转好的膜加入封闭液，室温封闭1 h后，除去封闭液，加入用一抗稀释液稀释好的一抗4℃过夜，回收已稀释的一抗，用TBST洗3次，每次5 min加入二抗稀释液稀释好的二抗，室温孵育30 min，用TBST在室温下摇床上洗4次，每次5 min，然后化学发光检测，使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.3 统计学处理所有资料采用SPSS22.0软件对实验数据进行分析，所得到的数值以±s表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 CCK‐8法检测结果与对照组相比，柚皮素组可抑制A549细胞增殖，且随浓度增加，增殖抑制作用更明显（P＜0.05），方差分析显示5组的存活率差异具有统计学意义（F=70.782，P＜0.001），见图1、表1。

图1 不同浓度的柚皮素对A549的细胞增殖的影响Fig.1 Effect of Nar at different concentrations on prolif-eration of A549 cells

图2 不同浓度的柚皮素对A549的细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of Nar on apoptosis of A549 cells

2.2 流式细胞仪检测结果与对照组相比，随着柚皮素浓度增加，A549细胞凋亡逐渐增加（P＜0.001），方差分析显示5组差异具有统计学意义（P＜0.001），见图2。与对照组相比，不同浓度柚皮素组MFI的表达升高（P＜0.001），且随柚皮素浓度增加，MFI呈明显升高趋势，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F=178.220，P＜0.001），见图3。

表1 不同浓度柚皮素作用下细胞活力的比较（±s，%）Tab.1 Comparison of cell viability under different con-centrations of Nar（±s，%）

表1 不同浓度柚皮素作用下细胞活力的比较（±s，%）Tab.1 Comparison of cell viability under different con-centrations of Nar（±s，%）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with 30µmol/L Nar，2）P=0.010；compared with 60µmol/L Nar，3）P＜0.001；compared with 90µmol/L Nar，4）P=0.001.

Cell viability 100.00±0.000 95.262±0.4781）89.855±0.4981）2）79.402±0.8061）3）70.264±0.7471）4）70.782 Groups Control 30µmol/L Nar 60µmol/L Nar 90µmol/L Nar 120µmol/L Nar F value n 3 3 3 3 3

2.3 WST‐8法、TBA法结果与对照组相比，不同浓度柚皮素组SOD活性均下降（P＜0.05），且随柚皮素浓度增加，SOD活性呈明显下降趋势，方差分析5组差异具有统计学意义（F=76.847，P=0.000），与对照组相比，不同浓度柚皮素组MDA含量均升高（P＜0.05），且随柚皮素浓度增加，MDA含量呈现明显升高趋势，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F=50.589，P=0.000），见图4、5。

2.4 Western blot检测结果

2.4.1 实验结果显示，与对照组相比，柚皮素组Nrf2、NQO1和HO‐1表达水平随着柚皮素浓度（30、60、90、120µmol/L）的增加而显著降低，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F值分别为55.063、93.609、192.155，P＜0.001），见图6。

图4 柚皮素对A549细胞中SOD活性的影响Fig.4 Effect of Nar on SOD acitivity in A549 cells

图5 柚皮素对A549细胞中MDA含量的影响Fig.5 Effects of Nar on MDA content in A549 cells

2.4.2 与对照组比较，柚皮素组P38 MAPK蛋白的磷酸化水平以及caspase‐3蛋白的活化水平随着柚皮素浓度（30、60、90、120 µmol/L）的增加而显著升高，方差分析5组差异具有统计学意义（F=108.073，P＜0.001），两两比较显示，与90µmol/L、120µmol/L柚皮素组相比，抑制剂组P38 MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase‐3蛋白活化水平降低（P＜0.05），与30µmol/L、60µmol/L柚皮素组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见图7。

图6 不同浓度的柚皮素对A549细胞中Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表达的影响Fig.6 Effects of Nar of different concentrations on expres-sion of Nrf2，NQO1 and HO‐1 in A549 cells

图7 不同浓度柚皮素对P‐P38 MAPK蛋白和caspase‐3蛋白表达的影响Fig.7 Effect of Nar in different concentrations on expres-sion of p‐p38 MAPK and caspase‐3 protein

3 讨论

柚皮素是黄酮类化合物家族的一员，富含于柑橘类水果和西红柿，具有多种预防性治疗特性［9］。已有研究表明，柚皮素在体内外对细胞有多种有益的作用，如抗病毒、抗癌、抗炎和心脏保护等［10］。最近研究发现，黄酮类化合物及其代谢物可发挥细胞内作用，包括直接调节细胞信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应［11］。研究发现，柚皮素可通过抑制PI3K/AKT通路中PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）‐31的活性来促进乳腺癌的凋亡，阻断细胞周期并调节AKT及NF‐κB信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖［12］。临床上，随着柚皮素摄入量的增加，癌症的总发病率显著降低［13］。本研究显示，柚皮素可呈浓度依赖性的抑制A549细胞增殖，并促使其凋亡。

研究表明，细胞膜脂质过氧化是高活性氧引起的主要氧化反应之一，导致丙二醛（MDA）的产生，活性氧（ROS）的产生与MDA水平的升高明显相关，超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，其活性反映了其清除氧自由基的能力［14‐15］；本研究显示，柚皮素可使A549细胞中SOD活性降低，同时使A549细胞中ROS、MDA的含量升高，且均呈浓度依赖性，因此可能是由于A549细胞对ROS的清除能力下降，进而导致细胞氧化应激损伤，这显示柚皮素促使细胞凋亡的机制可能是氧化应激反应。ROS负责JNK和p38通路的激活，从而导致细胞中其他促凋亡分子水平的升高［16］。本研究探讨了柚皮素是否可以诱导细胞内ROS的生成，并检测了细胞内ROS的水平，结果显示，柚皮素可以升高细胞内ROS水平，并呈浓度依赖性，并且可促使A549细胞发生凋亡。

p38丝裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）是哺乳动物的MAPKs之一，在肿瘤的发生发展中起着关键作用，可调节细胞增殖、分化、凋亡等［17‐18］。研究表明，MAPKs可以调节Nrf2的激活和HO‐1基因的表达［19］。Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链基因子集，通过结合抗氧化反应元件（ARE），激活靶基因表达，如HO‐1、NQO1、SOD，在 抗 氧 化 应 激 中 起 重 要 作用［20‐21］。HO‐1主要受Nrf2调控，是由Nrf2向细胞核的转移及其与HO‐1启动子的相互作用［22］。NQO1可以防止氧化应激，通常，NQO1表达较低，然而在氧化应激的情况下，细胞保护是通过激活ROS信号通路，导致多种下游因子的上调，包括NQO1，因此，NQO1是作为系统细胞氧化还原状态的重要标志［23］。本研究表明，柚皮素可浓度依赖地下调Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表达水平，这表明柚皮素可能通过P38 MAPK通路诱导A549细胞发生氧化应激反应。

ROS可通过激活MAPK激酶和抑制MAPK磷酸酶等多种途径导致p38 MAPK的持续活化［24］，例如，研究显示，紫草素可导致细胞内ROS的积累增加，导致线粒体膜电位损失、氧化损伤以及JNK和P38 MAPK通路的激活，进而导致A549细胞凋亡，呋喃酮可通过ROS介导的JNK和P38 MAPK通路激活，诱 导 结 直 肠 癌 细 胞 凋 亡［25］。SHIN［26］显 示，p38 MAPK抑制剂SB可阻断ROS引发的A549细胞凋亡。本研究发现柚皮素能显著提高（p）‐p38 MAPK水平，激活p38 MAPK信号通路，活化A549细胞中p38 MAPK和caspase‐3，浓 度 依 赖 地 下 调Nrf2、NQO1和HO‐1蛋白表达水平，因此，柚皮素可能通过增加磷酸化（p）‐p38 MAPK的表达诱导A549细胞凋亡。此外，SB可抑制该信号通路传导途径，显著降低柚皮素诱导的A549细胞的Nrf2、NQO1和HO‐1表 达 水 平，也 证 明 了Nrf2、NQO1和HO‐1受p38 MAPK信号通路的调控，提示柚皮素可能通过ROS/p38 MAPK通路诱导A549细胞发生凋亡。

综上所述，本研究探讨了柚皮素可对A549细胞产生增殖抑制作用和凋亡促进作用，并呈浓度依赖性，主要作用机制可能与其抑制了SOD的活性，导致细胞内ROS、MDA的含量升高，并下调相关蛋白的表达，从而与激活p38 MAPK信号通路相关。